本文選題：亞甲藍(lán)　切入點：腦卒中　出處：《中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腦卒中(stroke)是嚴(yán)重影響人類身體健康,甚至威脅生命的疾病。在我國,位列疾病死因第一位,每年發(fā)生腦卒中的病人達(dá)200萬。腦卒中分為兩類:缺血性腦卒中和出血性腦卒中,在我國缺血性卒中所占的比率為60%-80%。過去認(rèn)為缺血腦組織無法挽救,腦缺血半暗帶理論對于腦卒中的治療起到突破性的作用,使得腦梗塞的溶栓治療成為可能。然而,由于治療時間窗過窄(美國的治療時間窗為4.5 h,我國的治療時間窗為6 h),并有出現(xiàn)嚴(yán)重出血并發(fā)癥的危險,溶栓治療一直無法廣泛應(yīng)用,即使在發(fā)達(dá)國家,也僅有約5%的缺血性腦卒中患者能夠接受溶栓治療。因此,尋找一種切實有效的、緩解缺血性腦卒中損傷的神經(jīng)保護(hù)劑的研究具有重要的臨床意義。亞甲藍(lán)(Methylene blue,MB),是雜環(huán)芳香族化合物,自19世紀(jì)被Paul Ehrlich引入生物界,MB已經(jīng)被廣泛應(yīng)用于臨床。MB的主要特性之一是作用迅速,靜脈給藥5 min內(nèi)即可到達(dá)峰濃度。另一主要特性是對神經(jīng)組織具有高度親和力,可以輕易透過血腦屏障并積累在神經(jīng)組織中。一旦進(jìn)入細(xì)胞,MB很容易在線粒體質(zhì)子電勢的作用下進(jìn)入線粒體基質(zhì)中。線粒體是進(jìn)行能量代謝、維持氧化還原平衡的重要細(xì)胞器。它影響著細(xì)胞的生死存亡。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài),會導(dǎo)致線粒體受到損傷。引起線粒體膜電位降低,甚至線粒體外膜破裂,釋放多種細(xì)胞死亡相關(guān)蛋白,如細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子(Apoptosis-Inducing Factor,AIF)等。從而誘導(dǎo)細(xì)胞進(jìn)入凋亡或壞死途徑。發(fā)生缺血缺氧時,線粒體首先受到損傷,導(dǎo)致線粒體功能紊亂。通過線粒體自噬,清除了功能紊亂的線粒體,同時減少了由功能異常的線粒體產(chǎn)生的活性氧(Reactive Oxygen Species,ROS)以及誘導(dǎo)凋亡或壞死的信號分子的釋放。最近有研究表明,MB在神經(jīng)退行性疾病阿爾茲海默氏病中表現(xiàn)出提高自噬分子LC3-II的表達(dá)量、降低自噬連接蛋白p62水平的作用。推測MB可能通過促進(jìn)自噬,起到神經(jīng)保護(hù)的作用。MB可能是潛在的自噬促進(jìn)劑。到目前為止,僅有四篇MB顯著減少腦梗死體積的報道,其中三篇都是心臟驟停復(fù)蘇引發(fā)的全腦缺血再灌損傷。只有一篇應(yīng)用大腦中動脈閉塞(Middle Cerebral Artery Occlusion,MCAO)模型對腦缺血再灌進(jìn)行的研究。腦缺血再灌損傷和永久性腦缺血存在不同的發(fā)病機(jī)制。然而,目前尚無MB是否對永久性腦缺血具有保護(hù)作用的研究。本研究采用大鼠永久性腦缺血(permanent Middle Cerebral Artery Occlusion,p MCAO)模型模擬永久性缺血性腦卒中。首先觀察了MB對于大鼠永久性腦缺血的保護(hù)性作用,之后在低氧敏感神經(jīng)元樣細(xì)胞PC12上構(gòu)建細(xì)胞氧糖剝奪(Oxygen Glucose Deprivation,OGD)模型,模擬腦缺血。進(jìn)一步確認(rèn)了MB的腦保護(hù)作用,并揭示了其可能的作用機(jī)制。本研究表明MB能夠改善腦缺血24 h所致的神經(jīng)功能障礙,減少腦梗死體積與細(xì)胞壞死,引起線粒體自噬的發(fā)生,緩解了線粒體和細(xì)胞形態(tài)的惡化。在細(xì)胞水平,我們證實MB能維持OGD條件下的線粒體膜電位(Mitochondrial Membrane Potential,MMP,△Ψm),增加線粒體自噬,減少ROS的生成。進(jìn)一步證明MB是通過引起線粒體自噬,起到對缺血腦組織的保護(hù)作用的。主要研究結(jié)果如下:1.MB對永久性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用1.1 MB緩解了pMCAO大鼠神經(jīng)功能缺損采取三種方法:Longa評分法、爬格實驗、姿勢反射與肢體放置測驗對p MCAO大鼠神經(jīng)功能進(jìn)行評價。在術(shù)后24 h,與對照組(VC組)相比,亞甲藍(lán)的低劑量組(L組),中劑量組(M組),高劑量組(H組)三組大鼠神經(jīng)功能顯著改善,其中以MB中劑量組(5 mg/kg)效果最為顯著。1.2 MB顯著減少pMCAO大鼠腦梗死體積采用TTC染色判斷腦梗死體積變化。在我們的實驗中,假手術(shù)組(S組)大鼠腦組織未見到梗死區(qū)域,由大腦中動脈局灶性腦缺血24 h后,VC組大鼠出現(xiàn)了明顯的腦梗死灶。M組大鼠與VC組相比,腦梗死體積顯著降低約26%,L組、H組也出現(xiàn)了同樣的治療效果。1.3應(yīng)用MB治療,大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)得到改善,腫脹細(xì)胞率顯著降低應(yīng)用HE染色,光鏡觀察大鼠腦組織神經(jīng)細(xì)胞形態(tài)變化。缺血24 h后,VC組大鼠腦組織缺血灶區(qū)域細(xì)胞排列疏松、散亂,細(xì)胞間隙增大。細(xì)胞腫脹,著色變淺,細(xì)胞核染色不清,部分胞體皺縮,細(xì)胞空泡化。與VC組相比,MB的三個劑量組細(xì)胞形態(tài)的惡化得到緩解,腫脹細(xì)胞率顯著降低。1.4 MB顯著減少了pMCAO大鼠腦組織壞死神經(jīng)細(xì)胞的數(shù)量凋亡和壞死是腦缺血損傷后細(xì)胞死亡的主要形式。應(yīng)用Fluoro-Jade B(FJB)和TUNEL雙重?zé)晒馊旧夹g(shù),我們發(fā)現(xiàn)腦缺血24 h后神經(jīng)細(xì)胞壞死數(shù)量顯著增加,與VC組相比,MB的三個劑量組壞死神經(jīng)細(xì)胞數(shù)量均顯著降低。1.5 MB下調(diào)了p MCAO大鼠腦組織壞死相關(guān)分子RIP1和RIP3的表達(dá)RIP1和RIP3是目前已知的程序性壞死的關(guān)鍵信號分子。應(yīng)用western blot技術(shù),我們發(fā)現(xiàn),與對側(cè)(未損傷側(cè))相比,缺血側(cè)(損傷側(cè))RIP1和RIP3蛋白表達(dá)顯著升高,而中劑量MB抑制了RIP1和RIP3蛋白表達(dá)的上調(diào)。提示MB可能對p MCAO大鼠腦組織壞死有對抗作用。2.MB對永久性腦缺血大鼠的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制2.1 MB促進(jìn)了線粒體自噬,改善了線粒體形態(tài)Beclin1、LC3、p62和Tom20是線粒體自噬的重要相關(guān)分子,我們通過western blot技術(shù)對其含量表達(dá)變化進(jìn)行了檢測。與對照側(cè)相比,VC組缺血側(cè)Beclin1的表達(dá)顯著降低,LC3-II/I比例降低,p62和Tom20表達(dá)上調(diào)。而應(yīng)用MB治療后,無論是在缺血側(cè)還是對照側(cè)大腦半球,與VC組相比,MB都促進(jìn)了MCAO大鼠腦組織線粒體自噬的發(fā)生。借助透射電子顯微鏡,在MB治療組大鼠腦組織細(xì)胞中我們觀察到典型的線粒體自噬體。腦卒中后24 h大鼠腦組織皮層神經(jīng)元出現(xiàn)明顯的線粒體損傷。線粒體嵴紊亂、斷裂,線粒體的基質(zhì)顆粒大量消失,線粒體空泡化。而在MB的三個治療組,神經(jīng)細(xì)胞的形態(tài)得到明顯改善。通過線粒體評分的比較,我們發(fā)現(xiàn)中劑量MB的神經(jīng)保護(hù)作用最為顯著。這些結(jié)果提示,MB可能是通過增加線粒體自噬的發(fā)生來保證腦缺血后神經(jīng)細(xì)胞線粒體質(zhì)量的。2.2 MB通過促進(jìn)線粒體自噬,減少了腦缺血損傷我們構(gòu)建了PC12的OGD模型,經(jīng)western blot實驗發(fā)現(xiàn)在OGD 2 h后,MB促進(jìn)了Beclin1表達(dá)上調(diào),LC3-II/I比例升高以及p62和Tom20表達(dá)降低,這些都證明MB具有促進(jìn)自噬發(fā)生的作用。為了驗證MB是否是通過增加線粒體自噬來起到對腦缺血損傷的保護(hù)性作用的,我們應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測了自噬抑制劑3-MA對ROS含量變化的影響。我們發(fā)現(xiàn)OGD的發(fā)生引起ROS的爆發(fā)式增加,而MB的使用顯著抑制了該現(xiàn)象的出現(xiàn)。但當(dāng)同時使用自噬抑制劑3-MA時,MB的保護(hù)作用被抑制。這些實驗數(shù)據(jù)說明,MB在OGD下促進(jìn)線粒體自噬發(fā)生,減少了ROS的生成,起到保護(hù)作用。2.3MB阻止了OGD引起的ΔΨm降低，增加了線粒體自噬的發(fā)生實驗發(fā)現(xiàn),PC12細(xì)胞經(jīng)OGD處理2 h,ΔΨm陡然降低,MB減緩了這一趨勢的發(fā)生,然而在常氧狀態(tài)下,MB也會導(dǎo)致ΔΨm的降低。我們進(jìn)一步驗證了MB是否是通過對ΔΨm的影響來增加線粒體自噬。在實驗中加入解耦連劑羰基氰化物間氯苯腙(Carbonyl Cyanide-m-Chlorophenylhydrazone,CCCP),檢測線粒體自噬的變化。OGD時PC12細(xì)胞線粒體自噬活動被抑制,應(yīng)用MB,顯著增加了線粒體自噬的發(fā)生,但當(dāng)同時使用CCCP時,MB引起自噬發(fā)生的作用被抑制。這些現(xiàn)象說明,在OGD情況下,使用MB可以使ΔΨm維持在一個較高的水平,MB通過對ΔΨm的維持,促進(jìn)了線粒體自噬的發(fā)生。綜上所述,MB維持了ΔΨm的相對穩(wěn)定,增加了線粒體自噬的發(fā)生,對永久性缺血性腦卒中具有腦保護(hù)作用。因此,我們認(rèn)為MB可能是缺血性腦卒中的潛在的神經(jīng)保護(hù)藥物。2.3 MB阻止了OGD引起的△Ψm降低,增加了線粒體自噬的發(fā)生
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3

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本文編號：1599388