本文選題：硫化氫　切入點(diǎn)：AMPAR　出處：《華中科技大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分硫化氫對大鼠海馬CA1腦區(qū)AMPA受體膜轉(zhuǎn)運(yùn)的作用及機(jī)制 目的：硫化氫是一種氣體信號分子,參與對神經(jīng)突觸可塑性傳遞和學(xué)習(xí)記憶的調(diào)節(jié)。但是關(guān)于硫化氫調(diào)節(jié)突觸可塑性的分子機(jī)制,目前尚未研究清楚。本課題即從硫化氫對海馬腦區(qū)AMPA受體(a-amino-3-hydroxy-5-methyli soxazole-4-propionic acid receptor, AMPAR)上膜的調(diào)控方面,初步探討硫化氫對海馬腦區(qū)神經(jīng)元興奮性的調(diào)節(jié)作用及其分子機(jī)制。 方法：通過基于生物素交聯(lián)的硫巰基化檢測方法,研究硫化氫對大鼠海馬CA1腦區(qū)總蛋白、AMPAR和蛋白磷酸酯酶的硫巰基化作用。腦片膜片鉗記錄硫化氫對海馬CA1腦區(qū)神經(jīng)元AMPAR電流的作用。BS3交聯(lián)和蛋白質(zhì)免疫印跡方法,研究硫化氫對CA1腦區(qū)AMPAR亞基的磷酸化上膜和蛋白激酶磷酸化的作用。 結(jié)果：硫化氫供體硫氫化鈉(sodium hydrosulfide, NaHS,100μM)不影響大鼠海馬CA1區(qū)AMPAR亞基GluA1和GluA2的總蛋白表達(dá),也不改變GluA2的膜表達(dá),但能顯著增加GluA1膜表達(dá)和AMPAR介導(dǎo)的電流強(qiáng)度。硫巰基化阻斷劑DTT(二硫蘇糖醇,dithiothreitol,100μM)抑制NaHS引起的大鼠海馬CA1腦區(qū)AMPAR膜表達(dá)及其介導(dǎo)的電流強(qiáng)度。NaHS增加大鼠CA1腦區(qū)總蛋白硫巰基化水平,而對GluA1、 GluA2的硫巰基化水平無顯著影響。同時,NaHS增加GluAl亞基Ser845位點(diǎn)和Ser831位點(diǎn)磷酸化水平。另外,DTT能取消NaHS對海馬CA1腦區(qū)蛋白激酶A (protein kinase A, PKA)、蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)、鈣離子和鈣調(diào)素依賴的蛋白激酶Ⅱ (Ca2+/calmodulin dependent protein kinase Ⅱ, CaMKⅡ)的激活作用。NaHS選擇性地上調(diào)蛋白磷酯酶2A (protein phosphatase2A, PP2A)的硫巰基化水平,因此可能通過抑制PP2A活性而上調(diào)突觸后蛋白激酶信號以及GluAl的磷酸化和功能。 結(jié)論：硫化氫通過硫巰基化作用途徑促進(jìn)大鼠海馬CA1腦區(qū)AMPAR亞基GluAl-Ser845和Ser831位點(diǎn)的磷酸化,進(jìn)而上調(diào)AMPAR的膜表達(dá)和突觸后信號傳遞功能。 第二部分硫化氫對大鼠皮層神經(jīng)元興奮性及癲癇樣行為的作用及機(jī)制 目的：癲癇是伴隨腦卒中的一種常見并發(fā)癥,約占腦卒中患者總數(shù)的3%。然而,癲癇與腦卒中兩者之間的內(nèi)在機(jī)制聯(lián)系,仍然不甚明了。硫化氫作為一種氣體信號分子,在缺血性大腦損傷過程中具有關(guān)鍵作用。但是關(guān)于硫化氫在癲癇發(fā)作中的作用,目前還沒有相應(yīng)的研究報道。在本部分研究內(nèi)容中,我們初步探討了硫化氫對癲癇樣事件的影響及其機(jī)制。 方法：在戊四氮唑(pentylenetetrazole, PTZ)和毛果蕓香堿(pilocarpine)誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型上,檢測硫化氫對模型癲癇發(fā)作的影響。在低鎂高鉀癲癇模型和4-氨基吡啶(4-amino-pyridine,4-AP)誘導(dǎo)的腦片癲癇模型上,通過膜片鉗記錄的方法,研究硫化氫對癲癇樣動作電位發(fā)放、興奮性突觸后電流(excitatory postsynaptic currents, EPSCs)、電壓門控型鈉離子通道(voltage-gated sodium channels, VGSCs)電流、興奮性谷氨酸受體離子通道(AMPAR和NMDAR)電流的調(diào)節(jié)作用。 結(jié)果：腹腔注射NaHS(11.2mg/kg)增強(qiáng)戊四氮唑(癲癇等級：PTZ30:control,0.75±0.26, NaHS,2.37±0.57; PTZ45:control,2.87±0.44, NaHS,3.5±0.26;PTZ60:control,3.37±0.42,NaHS,4.13±0.29;PTZ75:control,4.12±0.23, NaHS,5.5±0.27)以及毛果蕓香堿(癲癇等級：30:control,2.25±0.16,NaHS,3.1±0.38；40:control,3.75±0.4,NaHS,3.88±0.44;50:control,3.63±0.26, NaHS,4.75±0.37:60:control,3.75±0.41,NaHS,4.75±0.42)誘發(fā)的癲癇模型發(fā)作。NaHS在腦片水平上延長低鎂高鉀(control,70±19s;NaHS,173±32s)和4.AP(control,29±8s;NaHS,42±13s)誘導(dǎo)的癲癇樣動作電位的持續(xù)發(fā)放時程。在不同的鉗制電流下(110-200pA)單獨(dú)使用NaHS,能夠增加大鼠腦片上動作電位的發(fā)放頻率(110pA:control,5.9±1.8,NaHS,14.2±2.5;120pA:control,9.6±2.1,NaHS,15.8±2.6;130pA:control,10.7±2.4,NaHS,18.1±2.8;140pA:control,13.0±2.4,NaHS,19.6±2.8；150pA:control,14.2±2.6,NaHS,21.7±2.7；160pA:control,16.4±2.8,NaHS,23.8±2.7;170pA:control,17.5±3.0,NaHS,25.1±3.1；180pA:control,19.3±3.3, NaHS,27.1±3.3190pA:control,20.3±3.6,NaHS,28.8±3.6;200pA:control,22.4±3.8,NaHS,30.8±3.4).NaHS上調(diào)大鼠皮層神經(jīng)元自發(fā)型興奮性突觸后電流(spontaneous excitatory postsynaptic currents,sEPSC)的幅度(control:31.16±1.09pA;NaHS:37.32±1.68pA)和微小型興奮性突觸后電流(miniature excitatory postsynaptic currents,mEPSC)的幅度(control:22.24±0.38pA;NaHS:25.69±0.66pA).在不影響VGSCs的激活、失活和復(fù)活特性的情況下,NaHS能增大VGSCs的電流幅度(NaHS,121.31±3.92％of control;P0.01).另外,NaHS能夠增加皮層神經(jīng)元總的誘發(fā)型興奮性突觸后電流(evoked excitatory postsynaptic currents,e-EPSC)幅度至對照組的146.4士10.9%、AMPAR介導(dǎo)的e-EPSC幅度至對照組的143.5士6.6%,以及NMDAR介導(dǎo)的e-EPSC幅度至對照組的128.1士3.1%。使用電壓門控型鈉通道阻滯劑TTX(1nmol)、NMDAR阻滯劑AP-5(100nmol)和AMPAR阻滯劑CNQX(20nmol)均能取消NaHS對低鎂高鉀誘導(dǎo)的癲癇樣發(fā)放以及戊四氮誘導(dǎo)的大鼠癲癇模型發(fā)作的促進(jìn)作用(Control:3.75±0.25,NaHS:5.25±4.12;TTX:2.12±0.55,TTX+NaHS:1.88±0.54;AP-5:3.5±0.57,AP-5+NaHS:2.87±0.72；CNQX:2.38±0.65, CNQX+NaHS:2.25±0.67). 結(jié)論：硫化氫通過上調(diào)電壓門控型鈉通道和谷氨酸受體通道活性,增強(qiáng)大腦皮層神經(jīng)元的興奮性,易化大鼠癲癇樣事件的發(fā)生。 第三部分硫化氫對大鼠ARC腦區(qū)神經(jīng)元活性及攝食行為的作用及機(jī)制 目的：硫化氫在機(jī)體的許多器官和組織中起到重要的生理或病理作用。已有研究報道提示,內(nèi)源性硫化氫可能對能量代謝和攝食具有調(diào)控作用。下丘腦弓狀核(arcuate nucleus, ARC)是控制機(jī)體能量代謝與攝食行為的關(guān)鍵調(diào)節(jié)中樞。饑餓狀態(tài)下ARC腦區(qū)neuropeptide Y (NPY)神經(jīng)元興奮,能量平衡因子AMP-activated protein kinase (AMPK)活性升高,介導(dǎo)攝食行為。本部分課題研究硫化氫對ARC神經(jīng)元AMPK活性和攝食的調(diào)控作用。 方法：采用大鼠腦室置管給藥、攝食行為測試、原代神經(jīng)元培養(yǎng)、western blotting免疫印跡、生物素交聯(lián)法和蛋白質(zhì)硫巰基水平檢測、鈣離子影像、氣體吸入給藥、細(xì)胞免疫熒光與親和素免疫組織化學(xué)(親和素-生物素-過氧化物酶法)的方法,研究硫化氫對大鼠攝食行為的調(diào)節(jié)作用及可能機(jī)制。 結(jié)果：腹腔注射NaHS (8.4mg/kg)可顯著短暫(1h)增加大鼠攝食行為。NaHS上調(diào)ARC神經(jīng)元c-Fos的核表達(dá)。在整體動物和離體腦片水平,NaHS濃度依賴性地增加下丘腦弓狀核AMPK和CaMKII活性。此外,100μM NaHS促進(jìn)原代培養(yǎng)ARC神經(jīng)元AMPK和CaMKII的激活。同時,NaHS促進(jìn)ARC神經(jīng)元胞漿游離鈣離子水平[Ca2+]i的升高,而胞漿游離鈣離子螯合劑BAPTA-AM (10μM)能阻斷硫化氫對AMPK的激活作用。NaHS不改變ARC總蛋白巰基水平而上調(diào)蛋白硫巰基化水平,該作用能被硫巰基化修飾阻斷劑DTT (100μM)所阻斷。DTT能取消硫化氫對胞漿鈣離子水平、AMPK激活和大鼠攝食的上調(diào)作用。氣體吸入硫化氫(20ppm)顯著增加ARC蛋白硫巰基化、AMPK激活以及大鼠攝食。禁食24h不改變下丘腦內(nèi)的硫化氫合酶——胱硫醚p合酶(cystathionine β-synthase, CBS)的表達(dá),但增加蛋白硫巰基化和AMPK激活水平。DTT可阻斷禁食引起的蛋白硫巰基化、AMPK激活和再攝食的增加。 結(jié)論：硫化氫通過硫巰基化作用,增強(qiáng)ARC神經(jīng)元胞內(nèi)鈣信號并激活A(yù)MPK,進(jìn)而上調(diào)ARC神經(jīng)元活性和促進(jìn)大鼠攝食。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741

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本文編號：1592816