本文選題：人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤　切入點(diǎn)：Cucurbitacin　出處：《山東大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景 膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(Glioblastoma Multiforme, GBM)被世界衛(wèi)生組織(WHO)定位星形細(xì)胞瘤IV級,是成人中樞系統(tǒng)中最常見的最具侵襲性的原發(fā)性惡性腫瘤,占所有膠質(zhì)瘤發(fā)病率的54%。目前,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的主要治療手段是手術(shù)切除、術(shù)后放療和術(shù)后化療的聯(lián)合治療方法。雖然人們在膠質(zhì)母細(xì)胞瘤具體治療方法上取得了一定改善,但總體療效收效甚微,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的中位生存期僅為12～14個(gè)月,5年生存率不到5%。因此,急需更加有效的治療手段來改善膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的治療現(xiàn)狀。 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與轉(zhuǎn)錄激活因子3(signal Transducers and Activators of Transcription, STAT3)是細(xì)胞因子/生長因子信號傳導(dǎo)中重要的胞質(zhì)轉(zhuǎn)錄因子,在調(diào)節(jié)細(xì)胞生長、生存、分化和凋亡中發(fā)揮著重要作用。STAT3在包括膠質(zhì)母細(xì)胞瘤在內(nèi)的許多種惡性腫瘤中表現(xiàn)為迷亂的活化狀態(tài)。研究表明阻斷STAT3持續(xù)的活化狀態(tài)可以有效抑制惡性腫瘤細(xì)胞的增殖和存活,誘導(dǎo)惡性腫瘤細(xì)胞凋亡,而且對人體正常的細(xì)胞影響較小。因此,可能成為治療惡性腫瘤的有效治療方法。 Cucurbitacin Ⅰ (JSI-124)是從葫蘆科和十字科植物中提取的天然三菇類化合物,是JAK2/STAT3的選擇性阻斷劑,具有很好穿透細(xì)胞膜和酪氨酸激酶抑制的功能。大量的研究表明Cucurbitacin Ⅰ對許多種惡性腫瘤細(xì)胞(乳腺癌、肺癌、神經(jīng)母細(xì)胞瘤、黑色素瘤及惡性膠質(zhì)瘤)具有潛在的抗癌活性。但是,人們對Cucurbitacin Ⅰ治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的機(jī)制并未完全闡明。 巨自噬(亦稱為自噬)是一種分解代謝的過程。自噬發(fā)生時(shí),包括細(xì)胞器在內(nèi)的胞漿內(nèi)容物被雙層膜(自噬體)包裹,接著與溶酶體融合形成自噬溶酶體從而將內(nèi)容物降解為可重復(fù)利用的小分子蛋白、多肽和氨基酸。在細(xì)胞應(yīng)激狀態(tài)下,如饑餓、缺血、缺氧、放射線照射、化療等,自噬能夠增強(qiáng)細(xì)胞生存能力。大量研究表明,應(yīng)用自噬抑制劑(Chloroquine、Hydroxychloroquine、bafilomycinA1、 monensin等)或敲除主要自噬相關(guān)基因(Beclin1、Atg5、Atg12等)抑制自噬后能夠增強(qiáng)許多抗癌制劑殺傷癌細(xì)胞能力,說明白噬在抗癌過程中對癌細(xì)胞起保護(hù)作用。 本課題旨在從自噬、凋亡等方面對Cucurbitacin I治療膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的具體機(jī)制進(jìn)行系統(tǒng)的研究。 目的 研究Cucurbitacin I誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤凋亡和自噬的相關(guān)機(jī)制,為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者提供新的有效的治療方法。 方法 一、體外 1.CCK-8法檢測不同時(shí)間點(diǎn)、不同濃度的Cucurbitacin I作用下的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251及T98G的細(xì)胞活力。 2. Western blot法檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G胞內(nèi)蛋白分子的表達(dá)水平。 3.免疫熒光實(shí)時(shí)觀測經(jīng)GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G中GFP-LC3陽性細(xì)胞的表達(dá)水平。 4.免疫熒光法觀測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G自噬蛋白分子LC3的表達(dá)水平。 5.透射電鏡觀測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G自噬體的表達(dá)水平。 6. TUNEL法檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G的凋亡水平。 7. ELISA法檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G的凋亡水平。 8.免疫共沉淀法檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251胞內(nèi)Bcl-2和Beclin1/hVps34復(fù)合體相互作用。 9. siRNA轉(zhuǎn)染法沉默膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G中的beclin1基因。 二、體內(nèi) 1.選用膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251建立人膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠異位模型。 2.通過測量荷瘤鼠平均體重和腫瘤平均體積大小從而檢測Cucurbitacin Ⅰ、氯喹及Cucurbitacin I聯(lián)合氯喹對荷瘤鼠副作用以及對荷瘤鼠的治療效果。 3.免疫組化法檢測腫瘤中LC3、Ki-67、Bax、Cleaved Caspase-3(p17)、Bcl-2以及Bcl-xL表達(dá)水平。 4.TUNEL法檢測腫瘤凋亡水平。 結(jié)果 一、Cucurbitacin I抑制GBM增殖 在體外,CCK-8法顯示與對照組相比,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株U251和T98G在Cucurbitacin I≥100nM作用下細(xì)胞活力下降明顯,且呈劑量-時(shí)間依賴效應(yīng)。在體內(nèi),對照組平均腫瘤體積為1286mm3(±251),Cucurbitacin I組平均腫瘤體積為412mm3(±82)；對照組和Cucurbitacin I組平均腫瘤重量分別是1,340mg (±260) and418mg (±80), Cucurbitacin I能有效抑制腫瘤體積和大小(P0.05)。另外,免疫組化顯示,Cucurbitacin I組Ki-67表達(dá)水平明顯下降(P0.001)。 二、Cucurbitacin I誘導(dǎo)GBM發(fā)生凋亡 在體外,TUNEL法檢測顯示,經(jīng)Cucurbitacin I治療的GBM細(xì)胞中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較對照組顯著性增加,且呈劑量依賴效應(yīng)(P0.001)。ELISA法表明,Cucurbitacin I組腫瘤細(xì)胞凋亡率較對照組顯著性增加,亦呈劑量依賴效應(yīng)(P0.001)。不同濃度Cucurbitacin I作用于GBM細(xì)胞后western blot檢測發(fā)現(xiàn),凋亡蛋白Bax和Cleaved Caspase-3(p17)表達(dá)明顯上調(diào),而抗凋亡蛋白Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)明顯下調(diào),且均呈劑量依賴效應(yīng)。另外,在體內(nèi),免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)腫瘤中Bax和Cleaved Caspase-3(p17)表達(dá)水平較對照組顯著性上調(diào),而Bcl-2和Bcl-xL表達(dá)較對照組顯著性下調(diào)。 誘導(dǎo)GBM發(fā)生自噬并激活自噬相關(guān)蛋白Cucurbitacin I三、beclin1 透射電鏡發(fā)現(xiàn),經(jīng)Cucurbitacin I治療的GBM細(xì)胞中自噬體數(shù)量較對照組顯著性增加(P0.05)。免疫熒光發(fā)現(xiàn)經(jīng)GFP-LC3瞬時(shí)轉(zhuǎn)染的GBM細(xì)胞在Cucurbitacin I治療后GFP-LC3陽性細(xì)胞數(shù)量較陰性對照組顯著性增加,且呈濃度依賴效應(yīng)。同樣,免疫熒光法檢測發(fā)現(xiàn)GBM細(xì)胞經(jīng)Cucurbitacin I治療后自噬 蛋白LC3B陽性細(xì)胞數(shù)量較陰性對照組亦顯著性增加,且呈劑量依賴效應(yīng)。另外,western blot顯示不同濃度Cucurbitacin I處理的GBM細(xì)胞中LC3B-II及Beclin1表達(dá)水平明顯上調(diào)；bafilomycin A1使GBM細(xì)胞中LC3B-II/LC3B-Ⅰ表達(dá)上調(diào),但bafilomycin A1聯(lián)合Cucurbitacin Ⅰ后LC3B-II/LC3B-Ⅰ上調(diào)更為明顯；Cucurbitacin Ⅰ治療后GBM細(xì)胞中p62水平下調(diào),bafilomycin A1治療后GBM細(xì)胞中p62水平上調(diào),而Cucurbitacin Ⅰ阻礙了bafilomycin A1對p62表達(dá)的上調(diào)。在體內(nèi),免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)Cucurbitacin Ⅰ組中LC3B表達(dá)水平較對照組顯著性增強(qiáng)。 四、Cucurbitacin Ⅰ激活GBM細(xì)胞中AMPK/mTOR/p70S6K信號通路 Western blot檢測發(fā)現(xiàn),經(jīng)不同濃度Cucurbitacin Ⅰ治療的GBM細(xì)胞p-AKT及AKT表達(dá)水平不變,而使p-AMPK, p-mTOR以及p-p70S6K水平活化,且呈劑量依賴效應(yīng)。 五、Cucurbitacin Ⅰ激活GBM細(xì)胞中JAK2/STAT3/HIF-1α信號通路 Western blot檢測表明,不同濃度Cucurbitacin Ⅰ治療的GBM細(xì)胞p-JAK2、 p-STAT3、HIF-1α表達(dá)水平下調(diào),且呈劑量依賴效應(yīng)。 六、下調(diào)的HIF-1α在Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)GBM細(xì)胞自噬中發(fā)揮重要作用 透射電鏡和免疫熒光分別發(fā)現(xiàn),HIF-1α穩(wěn)定劑FG-4497顯著降低Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞自噬體數(shù)量增加和GFP-LC3陽性細(xì)胞數(shù)量增加(P0.05)。Western blot檢測表明,FG-4497顯著增加GBM細(xì)胞HIF-1α水平,抑制了Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的Bcl-2表達(dá)水平下調(diào)以及LC3B-I向LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化。敲除Beclin1以及給予自噬抑制劑3-MA能夠阻礙Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的LC3B-Ⅰ向LC3B-Ⅱ轉(zhuǎn)化。免疫共沉淀顯示對照組中Bcl-2和Beclin1/hVps34相互關(guān)聯(lián),而在Cucurbitacin Ⅰ治療的GBM細(xì)胞中Bcl-2和Beclinl/hVps34關(guān)聯(lián)顯著性下降。 七、抑制自噬能夠增強(qiáng)Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡 CCK-8法檢測表明,自噬抑制劑氯喹(CQ)顯著性增強(qiáng)Cucurbitacin Ⅰ抑制GBM細(xì)胞增殖的能力(P0.05)。ELISA法和TUNEL法檢測發(fā)現(xiàn)氯喹(CQ)顯著性增強(qiáng)Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡。另外,SiRNA沉默GBM細(xì)胞beclin1表達(dá)后,能夠顯著增強(qiáng)Cucurbitacin Ⅰ抑制GBM細(xì)胞增殖的能力以及Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡(P0.05)。 八、在人膠質(zhì)瘤荷瘤裸鼠異位模型中,CQ增強(qiáng)Cucurbitacin Ⅰ對腫瘤生長的抑制作用 實(shí)驗(yàn)終末階段,測量的腫瘤平均體積大小分別是：對照組(DMSO),616mm3(±130)；CQ組,580mm3(±107); cucurbitacin Ⅰ組,346mm3(±79)；CQ聯(lián)合cucurbitacin Ⅰ組,220mm3(±62)。CQ組與對照組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,而cucurbitacin Ⅰ組與對照組、CQ聯(lián)合cucurbitacin Ⅰ組與對照組以及CQ聯(lián)合cucurbitacin Ⅰ組與cucurbitacin Ⅰ組相比差異性顯著(P0.05)。另外,CQ聯(lián)合cucurbitacin Ⅰ組腫瘤平均瘤重與cucurbitacin Ⅰ組相比差異性顯著(P0.01)。平均荷瘤鼠體重在各組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。最后,免疫組化檢測發(fā)現(xiàn),cucurbitacin Ⅰ組中Ki-67表達(dá)水平較對照組差異性顯著(P0.01):CQ聯(lián)合cucurbitacin Ⅰ組中Ki-67表達(dá)水平較cucurbitacin Ⅰ組差異性顯著(P0.01)。TUNEL法檢測表明,cucurbitacin Ⅰ組中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較對照組差異性顯著(P0.01)；而CQ聯(lián)合cucurbitacin Ⅰ組中TUNEL陽性細(xì)胞數(shù)較cucurbitacin Ⅰ組差異性顯著(P0.05)。 結(jié)論 一、Cucurbitacin Ⅰ在體外和體內(nèi)均能有效抑制GBM增殖。 二、Cucurbitacin Ⅰ通過調(diào)節(jié)bcl-2家族蛋白水平誘導(dǎo)GBM凋亡。 三、Cucurbitacin Ⅰ通過激活A(yù)MPK/mTOR/p70S6K信號通路誘導(dǎo)GBM發(fā)生自噬。 四、Cucurbitacin Ⅰ下調(diào)GBM細(xì)胞中HIF-1α和bc1-2水平并抑制Beclin1/hVps34復(fù)合體關(guān)聯(lián)。 五、在體外和體內(nèi),抑制自噬有效增強(qiáng)Cucurbitacin Ⅰ誘導(dǎo)的GBM細(xì)胞凋亡。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.41

【共引文獻(xiàn)】

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本文編號：1590355