本文選題：肌衛(wèi)星細(xì)胞　切入點(diǎn)：轉(zhuǎn)化生長因子-β1　出處：《遵義醫(yī)學(xué)院》2017年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:探討兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞分離提取和培養(yǎng)方法,并觀測TGF-β1、MGF在不同濃度和時間對體外培養(yǎng)的兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞增殖及分化的影響。方法:1.選取一周焍健康乳兔,采用改良混合酶消化結(jié)合差速貼壁法,分離提取骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞(SMSCs),原代培養(yǎng)行Desmin免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定;2.取生長良好的第三代SMSCs以8x103個/m L的密度接種于96孔板,設(shè)對照組、不同濃度梯度的TGF-β1組(0.5、1、2、5、10、20ng/m L)和MGF組(15、30、45、75、100、125ng/m L),加藥后各組繼續(xù)培養(yǎng)6d,顯微鏡下觀察細(xì)胞的生長情況,每間隔24h,CCK-8法檢測各組的OD值,確定相對最佳作用的TGF-β1和MGF濃度;3.CCK-8法檢測相對最佳作用濃度下TGF-β1組、MGF組和TGF-β1+MGF組及對照組的OD值,Real time PCR檢測(對照組、TGF-β1組和MGF組)第0、2、4、6天Myf5和Myogenin m RNA水平變化。結(jié)果:1.分離提取的家兔細(xì)胞經(jīng)免疫細(xì)胞化學(xué)Desmin染色呈強(qiáng)陽性表達(dá)。2.不同濃度TGF-β1和MGF干預(yù)CCK-8檢測的OD值(1)TGF-β1組:第4天增殖效果顯現(xiàn),10ng/m L組OD值顯著高于對照組及其他濃度組(P0.01);第5天,各濃度實(shí)驗(yàn)組OD值均高于對照組(P0.01),其中10ng/m L組OD值顯著高于其他各組(P0.01),20ng/m L組OD值顯著高于0.5ng/m L、1ng/m L組、2ng/m L組、5ng/m L組(P0.05);第6天,各實(shí)驗(yàn)組OD值均高于對照組(P0.01),其中10ng/m L組OD值顯著高于其他各組(P0.01),0.5ng/m L組OD值低于1ng/m L組、2ng/m L組(P0.01),1ng/m L組OD值與2ng/m L組無顯著差異(P0.05)。確定10ng/m L TGF-β1為相對最佳效應(yīng)濃度值。(2)MGF組:第2天增殖效應(yīng)開始顯現(xiàn),各劑量實(shí)驗(yàn)組OD值均顯著高于對照組(P0.01),100ng/m L組OD值顯著高于15ng/m L組、30ng/m L組、45ng/m L組(P0.05);第3、4、5天各組的OD值進(jìn)一步增高,但整體上升趨勢同第2天;第6天,45ng/m L組、75ng/m L組、100ng/m L組、125ng/m L組OD值均顯著高于對照組(P0.01),而15ng/m L組、30ng/m L組與對照組比較差異無顯著性(P0.05),且其OD值均顯著低于45ng/m L組、75ng/m L組、100ng/m L組、125ng/m L組(P0.01),100ng/m L組的OD值均顯著高于其余各組(P0.01)。確定100ng/m L的MGF為最佳效應(yīng)濃度值。(3)相對最佳濃度組:第2天,MGF組(100ng/m L)OD值顯著高于對照組(P0.01),而TGF-β1組(10ng/m L)和TGF-β1+MGF組的OD值與對照組比較無顯著差異(P0.05);第3天至第6天,TGF-β1組、MGF組的OD值均顯著高于對照組(P0.01),同時MGF組的OD值顯著高于TGF-β1組的(P0.01),但TGF-β1+MGF組OD值與對照組比較無顯著性差異(P0.05)。3.Myf5、Myogenin的m RNA水平對照組、TGF-β1組、MGF組Myf5的m RNA表達(dá)量呈先上升后下降的趨勢,Myogenin呈低量弱表達(dá)后緩慢上升的趨勢。TGF-β1組第4天Myf5的m RNA表達(dá)量高于第0天(P0.01),雖也高于同期的對照組,但無顯著性差異(P0.05);TGF-β1組Myogenin的m RNA表達(dá)量在6天的細(xì)胞培養(yǎng)期內(nèi)與同期的對照組比較無顯著性差異(P0.05)。MGF組第2天Myf5的m RNA表達(dá)量顯著高于同期的對照組及TGF-β1組(P0.05),第4天的表達(dá)量雖高于同期對照組及TGF-β1組,但也均無顯著性差異(P0.05);MGF組Myogenin在第4天、6天的m RNA表達(dá)量均顯著低于對照組和TGF-β1組(P0.05)。結(jié)論:1.采用混合酶消化結(jié)合差速貼壁法成功分離提取家兔骨骼肌衛(wèi)星細(xì)胞,實(shí)現(xiàn)肌衛(wèi)星細(xì)胞的體外培養(yǎng)和鑒定。2.TGF-β1在0.5~20ng/m L范圍內(nèi)對兔SMSCs有促增殖效應(yīng),以10ng/m L時促增殖效果相對最佳,但對兔SMSCs抑制分化的作用較弱。3.MGF在15~125ng/m L范圍內(nèi)對兔SMSCs有促增殖效應(yīng),以100ng/m L時促增殖效果相對最佳,且該濃度對兔SMSCs有較強(qiáng)的抑制分化效應(yīng)。4.相對最佳濃度TGF-β1和MGF作用于兔SMSCs時,MGF促增殖效果強(qiáng)于TGF-β1,但二者聯(lián)用時并無明顯促增殖效應(yīng)。
[Abstract]:Objective: To investigate the isolation and culture method of rabbit skeletal muscle satellite cells, and observed the TGF- beta 1, MGF on cultured in different concentration and time of cell proliferation and differentiation of rabbit skeletal muscle satellite. Method: 1. choose a week Di health rabbit, using a modified hybrid enzyme digestion combined with differential adhesion method the extraction, separation of skeletal muscle satellite cells (SMSCs), cultured for Desmin immunocytochemistry identification; 2. good growth of the third generation of SMSCs /m L with 8x103 were inoculated in 96 well plate, control group, different concentration gradient of TGF- beta 1 group (0.5,1,2,5,10,20ng/m L) and MGF group (15,30,45,75100125ng/m L), were cultured for 6D after treatment, cell growth was observed under a microscope, every 24h, OD value was detected by CCK-8 method, to determine the relative best effect of TGF- beta 1 and MGF concentration; 3.CCK-8 method was used to detect the phase of the optimal concentration of TGF- beta 1 group, MGF 緇勫拰TGF-尾1+MGF緇勫強(qiáng)瀵圭収緇勭殑OD鍊，

本文編號：1580709