本文選題：嵌合抗原受體　切入點：慢病毒　出處：《河南大學》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景:腦膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)性惡性腦瘤,盡管其治療方式有多種,但最大范圍的手術切除、放療和化療都未能達到滿意療效。這些治療方式因?qū)φＤX組織和其他組織具有非特異性損傷而受到了限制。傳統(tǒng)治療方式的缺點刺激了新療法的發(fā)展,相比較而言,免疫治療是一個精確的療法,能夠有效的靶向神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤,減少脫靶效應對正常腦組織導致的間接損傷。大量臨床證據(jù)已展示免疫治療在B細胞惡性腫瘤和實體腫瘤等治療上所具有的潛力。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)是一種久經(jīng)考驗的方法,它將特異性抗體的可變區(qū)與T細胞的功能結合,表達于T淋巴細胞表面介導其抗原特異性激活,CAR在腎細胞癌、神經(jīng)母細胞瘤、急性淋巴細胞白血病、慢性淋巴細胞白血病等惡性疾病的治療中表現(xiàn)出了非凡的潛能,在過去的20多年里,有關CAR的技術發(fā)展極其迅速,CAR也已經(jīng)從實驗室轉(zhuǎn)化到膠質(zhì)瘤的臨床治療中。表皮生長因子受體III型突變體(epidermal growth factor receper variant III,EGFRv III)表達于腦膠質(zhì)瘤和其他惡性腫瘤的表面而在正常組織不表達,是靶向治療的最佳靶點。本實驗構建嵌合抗原受體sc Fv EGFRv III-CD28-CD3ζ,利用sc Fv EGFRv III實現(xiàn)靶向免疫治療膠質(zhì)瘤細胞,共刺激分子CD28促進T細胞的擴增,延長T細胞壽命,CD3ζ激活T細胞毒性反應。以慢病毒為載體介導EGFRv III/CD28-CAR重定向T細胞,使T細胞特異性識別并殺傷EGFRv III陽性腦膠質(zhì)瘤細胞(EGFRv III+U87MG),是膠質(zhì)瘤免疫治療的新思路。目的:構建第二代慢病毒表達載體p CDH-CD28-CAR;探討EGFRv III/CD28-CAR+T細胞對EGFRv III+U87MG細胞的體外生物學效應。方法:第一部分(1)委托公司合成基因片段Hinge-TM-CD28-CD3ζ;將Hinge-TM-CD28-CD3ζ克隆至慢病毒表達載體p CDH-EF1-MCS-T2A-cop GFP的Bam HI和Eco RI位點,獲得的載體被命名為p CDH-CD28-CD3ζ;PCR擴增p CR2.1TOPO中的sc Fv EGFRv III基因序列;將sc Fv EGFRv III克隆至p CDH-CD28-CD3ζ的Eco RI位點,采用菌落PCR方法判斷sc Fv EGFRv III與p CDH-CD28-CD3ζ的連接是否正確,最后DNA測序鑒定各堿基是否正確,新載體命名為p CDH-CD28-CAR。(2)通過磷酸鈣沉淀法將三質(zhì)粒(包膜蛋白質(zhì)粒p VSVG、包裝質(zhì)粒p Del8.9和p CDH-CD28-CAR)共轉(zhuǎn)染293T細胞包裝慢病毒;使用蔗糖超速離心沉淀法濃縮慢病毒上清液;使用有限稀釋法測定慢病毒(LV EGFRv III/CD28-CAR)的滴度。第二部分(1)慢病毒LV EGFRv III/CD28-CAR感染運用免疫磁珠技術分離、激活、擴增的健康供著外周血CD3+T細胞。(2)運用Western blot和流式細胞術檢測EGFRv III/CD28-CAR在T細胞的表達情況,ELISA法檢測效靶共培養(yǎng)上清細胞因子IFN-γ的分泌水平,51Cr釋放法檢測EGFRv III/CD28-CAR+T細胞的殺傷效應。結果:第一部分(1)DNA測序鑒定CAR的sc Fv EGFRv III、Hinge、TM、CD28和CD3ζ的序列和連接正確,成功構建了慢病毒表達載體p CDH-CD28-CAR;(2)包裝的慢病毒LV-EGFRv III/CD28-CAR滴度高達1.2x108 TU/ml,LV-EGFRv III/CD28-CAR感染T細胞的效率高達73.9%。第二部分體外實驗顯示效靶細胞共培養(yǎng)上清中可檢測到明顯的IFN-γ分泌,EGFRv III/CD28-CAR+T細胞可以特異性的殺傷EGFRv III+U87細胞,EGFRv III/CD28-CAR+T細胞發(fā)揮殺傷效應和分泌IFN-γ均依賴U87MG細胞EGFRv III的表達。結論:體外實驗證實了EGFRv III/CD28-CAR+T細胞對EGFRv III+U87MG細胞的特異性殺傷作用,為下一步體內(nèi)實驗打下了基礎。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R739.41

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