本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)膠質(zhì)瘤 SPOCK1 增殖 凋亡 遷移 侵襲 PI3K/AKT Wnt/β-catenin　出處：《吉林大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：神經(jīng)膠質(zhì)瘤(glioma)是最常見的中樞神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,其占中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤的30%和全部惡性顱內(nèi)腫瘤的80%。神經(jīng)膠質(zhì)瘤多來源于少突膠質(zhì)細胞,星形膠質(zhì)細胞以及室管膜。神經(jīng)膠質(zhì)瘤病理類型包括少突膠質(zhì)細胞瘤、膠質(zhì)母細胞瘤、室管膜瘤、以及星形膠質(zhì)細胞瘤等。由于腫瘤細胞的增殖及瘤體積的增大,壓迫中樞神經(jīng)并引起顱內(nèi)壓升高,導(dǎo)致極高的致死率。目前神經(jīng)膠質(zhì)瘤的治療手段多為外科手術(shù)結(jié)合化療和放療的聯(lián)合療法。外科手術(shù)最為有效,但其對正常腦組織的損傷也最為嚴(yán)重。同時,多數(shù)神經(jīng)膠質(zhì)瘤呈浸潤性生長,外科手術(shù)無法將其完全切除,因而其術(shù)后復(fù)發(fā)率很高。放療對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用有限,往往作為輔助手段,由于血腦屏障的存在,限制了很多化療藥物的應(yīng)用。因此,深入研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤的分子發(fā)病機理,尋找其發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)的信號通路及其關(guān)鍵分子靶點,對于早期防治及其開拓神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的新途徑至關(guān)重要。SPOCK1是編碼基質(zhì)細胞糖蛋白家族的成員,它們均隸屬于BM-40/SPARC/骨粘連蛋白家族,它的分子結(jié)構(gòu)特點說明它可以作為一種黏附蛋白,不僅能夠參與細胞基質(zhì)與細胞表面的相互作用,而且能夠參與細胞形態(tài)改變、參與細胞增殖及遷移過程,因而在物種生存中發(fā)揮重要作用。近年來的研究發(fā)現(xiàn),SPOCK1在肝癌、肺癌、前列腺癌、膽囊癌、卵巢癌等惡性腫瘤組織中出現(xiàn)過度表達的現(xiàn)象,并與其病理分型及惡化程度呈正相關(guān),揭示了SPOCK1與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展有著密切聯(lián)系。最近的一項研究表明SPOCK1在多型性膠質(zhì)母細胞瘤和纖維型星形細胞瘤組織中高表達,說明SPOCK1基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生與發(fā)展過程中可能發(fā)揮重要作用。然而,SPOCK1對人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞生物學(xué)功能改變的影響,以及其潛在的發(fā)生機制國內(nèi)外僅有1篇文獻報道。本研究在國內(nèi)外研究進展基礎(chǔ)上,通過基因工程重組技術(shù)在人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞內(nèi)沉默SPOCK1基因以及過表達SPOCK1基因等,系統(tǒng)評價SPOCK1基因?qū)θ松窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響,并進一步研究SPOCK1基因?qū)I3K/AKT和Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的作用,從而探討SPOCK1與神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展之間的作用及其涉及的信號通路與分子靶點。本研究主要取得以下學(xué)術(shù)進展:1.分別成功構(gòu)建了SPOCK1基因沉默及過表達載體,為研究SPOCK1在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的作用奠定了實驗基礎(chǔ)。根據(jù)SPOCK1基因序列設(shè)計靶向抑制該基因表達sh RNA序列,并在體外人工合成,通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)入SPOCK1基因高表達的U87MG細胞株。將過表達質(zhì)粒穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SPOCK1低表達的U251細胞株,轉(zhuǎn)染細胞通過G418進行穩(wěn)定篩選,應(yīng)用實時熒光定量PCR與Western blot檢測SPOCK1基因的干擾效率。其檢測結(jié)果顯示穩(wěn)定轉(zhuǎn)染sh RNA的U87MG細胞株的SPOCK1基因在m RNA以及蛋白水平表達受到抑制,穩(wěn)定轉(zhuǎn)染過表達質(zhì)粒的U251細胞株的SPOCK1基因在m RNA以及蛋白水平表達升高,與對照組相比具有顯著性差異。2.證實了沉默SPOCK1基因顯著抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖,而SPOCK1基因過表達則顯著促進人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖。我們利用穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細胞株,通過CCK8方法檢測各組細胞的增殖情況,發(fā)現(xiàn)SPOCK1基因沉默后明顯抑制U87MG細胞株的細胞增殖,當(dāng)SPOCK1基因表達上調(diào)后明顯增強U251細胞株的增殖能力。為了更好的反映細胞的增殖能力,我們利用平板克隆形成實驗,對各組中形成的單克隆細胞群計數(shù),在接種細胞數(shù)的基礎(chǔ)上,計算克隆形成率,實驗結(jié)果提示SPOCK1基因沉默后明顯抑制U87MG細胞株的克隆形成能力,SPOCK1基因表達上調(diào)后U251細胞株的克隆形成能力增強。通過流式細胞技術(shù)檢測各組細胞在不同細胞周期的細胞比例,結(jié)果提示SPOCK1基因沉默后,G1期細胞比例明顯增多,在G2/M期,細胞比例顯著減少。在過表達SPOCK1基因組,G1期的細胞比例減少,G2/M期細胞比例顯著增多。通過免疫熒光測定技術(shù)檢測增殖細胞核抗原(PCNA)的分析結(jié)果進一步提示SPOCK1基因沉默引起PCNA熒光強度減弱,而SPOCK1基因過表達引起PCNA熒光強度增強,提示SPOCK1基因通過上調(diào)PCNA的表達促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖。3.證實了沉默SPOCK1基因可顯著促進人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡,而SPOCK1基因過表達則顯著抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的凋亡。分別將SPOCK1基因沉默載體與過表達穩(wěn)定轉(zhuǎn)染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株,通過流式細胞儀分析各組細胞凋亡間的差異,Hoechst染色觀察凋亡細胞的細胞核,分析結(jié)果顯示SPOCK1基因表達受抑制的U87MG組細胞株發(fā)生了明顯的細胞凋亡,而SPOCK1基因過表達的U251細胞株的細胞凋亡明顯受到抑制。為了進一步驗證SPOCK1對細胞凋亡的影響,我們通過Western blot方法檢測細胞凋亡相關(guān)蛋白的表達,研究結(jié)果顯示SPOCK1基因表達下調(diào)后抑制了Bcl-2的表達,促進了Bax,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表達.反之,SPOCK1基因表達上調(diào)促進了Bcl-2的表達,抑制了Bax,cleaved-caspase-3和cleaved-PARP的表達,提出了SPOCK1通過影響多種凋亡關(guān)鍵蛋白的表達抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞凋亡的分子機制。4.證實了SPOCK1基因沉默后人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲能力顯著減低,而SPOCK1基因過表達人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲顯著增強。為了研究SPOCK1基因?qū)θ松窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲的影響,我們首先通過劃痕實驗觀察各組細胞的遷移能力,分別觀察0h,12h,24h各組間差別,測量寬度縮小的比例區(qū)別計算遷移能力差異,研究結(jié)果顯示在SPOCK1基因表達下調(diào)的U87MG組細胞株遷移能力明顯受到抑制,而在SPOCK1基因表上調(diào)的U251組細胞株中細胞的遷移能力明顯增強。隨后,我們通過Transwell小室實驗觀察各組細胞的侵襲能力,研究結(jié)果表明SPOCK1基因表達上調(diào)促進人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲,SPOCK1表達下調(diào)抑制人神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的侵襲。為進一步確定SPOCK1基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞轉(zhuǎn)移能力的影響,通過明膠酶譜及Western blot實驗檢測MMP2,MMP9的活性及蛋白表達,結(jié)果表明U87MG組細胞中MMP2和MMP9的活性和表達受到了SPOCK1基因表達下調(diào)的抑制,而U251組中SPOCK1基因表達上調(diào)促進了MMP2和MMP9的活性和表達,率先闡述了SPOCK1基因過表達促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞遷移、侵襲的分子機理與相關(guān)的分子靶點。5.證實了SPOCK1基因通過調(diào)控PI3K/AKT及Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株的生物學(xué)功能。為了進一步探討SPOCK1基因?qū)ι窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞作用的分子發(fā)病機制,我們首先通過Western blot檢測PI3K/AKT通路相關(guān)蛋白表達,結(jié)果顯示SPOCK1基因沉默后p-PI3K,p-AKT蛋白表達水平下調(diào),相反,SPOCK1基因表達上調(diào),促進p-PI3K,p-AKT蛋白表達。鑒于Wnt/β-catenin信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生和發(fā)展中同樣發(fā)揮著重要作用,因此我們利用Western blot檢測Wnt1和β-catenin的表達水平并同時檢測了其下游靶基因c-MYC和Cyclin D1的蛋白表達,研究結(jié)果表明SPOCK1基因沉默后,Wnt1,β-catenin、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表達水平隨之下調(diào),相反,SPOCK1基因表達上調(diào),促進Wnt1,β-catenin、c-MYC、Cyclin D1的蛋白表達。進一步證實了SPOCK1基因通過PI3K/AKT、Wnt/β-catenin信號通路及其關(guān)鍵分子靶點促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞的增殖。綜合上述研究得到以下結(jié)論:本研究通過使SPOCK1基因沉默及過表達兩個方面證實SPOCK1基因?qū)θ松窠?jīng)膠質(zhì)瘤細胞增殖、凋亡、遷移、侵襲的影響。初步探討了SPOCK1基因可能通過調(diào)控PI3K/AKT和Wnt/β-catenin信號通路影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞株的生物學(xué)功能。研究結(jié)果說明SPOCK1基因起到了促腫瘤發(fā)生的作用,有望成為神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的新靶點。
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【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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本文編號：1554803