本文關(guān)鍵詞： Toll樣受體4(TLR4) 帕金森病 小膠質(zhì)細(xì)胞 神經(jīng)炎癥 促炎癥因子 1-甲基-4-苯基-1 2 3 6-四氫吡啶(MPTP)　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年博士論文　論文類(lèi)型：學(xué)位論文

【摘要】：帕金森病(PD)是以黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元選擇性進(jìn)行性丟失為病理特征的神經(jīng)變性疾病,其發(fā)生與黑質(zhì)紋狀體中多巴胺含量減少有關(guān)。隨著人口老年化的到來(lái),其患病率逐年增高,已成為僅次于老年性癡呆的神經(jīng)系統(tǒng)第二大變性疾病。目前在我國(guó)65歲以上老年人群中,帕金森病的患病率為1.7%,與發(fā)達(dá)國(guó)家相近,給社會(huì)造成了沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)和嚴(yán)重影響著老年人的生活質(zhì)量。但是帕金森病的病因至今未明,研究提示可能與年老、環(huán)境因素及遺傳因素有關(guān),其發(fā)病機(jī)制也涉及自由基、氧化應(yīng)激、谷氨酸興奮性毒性、線粒體復(fù)合物I缺失、神經(jīng)慢性炎癥、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子缺乏和凋亡等,在級(jí)聯(lián)生化反應(yīng)中這些機(jī)制相互作用最終導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。但確切的發(fā)病機(jī)制尚不清楚。藥物治療是應(yīng)用最廣泛的帕金森病治療手段,但已有的抗帕金森病藥物只能改善癥狀,不能延緩疾病進(jìn)程,且長(zhǎng)期應(yīng)用會(huì)有嚴(yán)重的毒副作用。因此急需找到更為有效的防治手段。流行病學(xué)調(diào)查觀察到非類(lèi)固醇類(lèi)抗炎藥可降低遠(yuǎn)期帕金森病發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)的現(xiàn)象。目前,在許多神經(jīng)炎癥及神經(jīng)變性疾病可以觀察到變性的神經(jīng)元周?chē)屑せ畹男∧z質(zhì)細(xì)胞積聚。由于小膠質(zhì)細(xì)胞的過(guò)度活化導(dǎo)致炎癥和氧化應(yīng)激的發(fā)生而損傷多巴胺能神經(jīng)元,是PD的重要發(fā)病機(jī)制。許多神經(jīng)變性疾病包括AD和PD疾病進(jìn)程中神經(jīng)炎癥被認(rèn)為是關(guān)鍵的發(fā)病機(jī)制。幾個(gè)研究均發(fā)現(xiàn)激活的小膠質(zhì)細(xì)胞能釋放神經(jīng)破壞家族或神經(jīng)毒性致炎細(xì)胞因子,包括NO、TNFα、PGE2、IL-1β和IL-6。這些促炎癥細(xì)胞因子能在神經(jīng)炎癥進(jìn)程中經(jīng)由受體依賴(lài)的細(xì)胞凋亡途徑加重神經(jīng)元的損傷。因此,可能有效的治療策略就是抑制包括小膠質(zhì)細(xì)胞在內(nèi)的炎癥反應(yīng)過(guò)程起到神經(jīng)保護(hù)作用。但小膠質(zhì)細(xì)胞的激活途徑及其釋放炎癥因子在帕金森病發(fā)病過(guò)程中所起的作用尚存在爭(zhēng)論。Toll樣受體(TLRs)是一類(lèi)細(xì)胞表面信號(hào)傳導(dǎo)跨膜受體,屬于I類(lèi)跨膜受體,它不僅在天然免疫系統(tǒng)中識(shí)別病原微生物、激活先天性免疫應(yīng)答,是天然免疫系統(tǒng)識(shí)別病原微生物的主要受體；而且還使抗原提呈細(xì)胞識(shí)別病原體、產(chǎn)生共刺激信號(hào)而啟動(dòng)獲得性免疫反應(yīng),是人體先天免疫和后天獲得性免疫的橋梁�，F(xiàn)有的研究提示TLRs與神經(jīng)變性疾病有關(guān)。Miguel等的最新研究結(jié)果提示Toll樣受體4(TLR4)誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化。因此我們認(rèn)為：抑制對(duì)于小膠質(zhì)細(xì)胞的活化誘導(dǎo)的炎癥介質(zhì)的釋放起到的神經(jīng)保護(hù)作用遠(yuǎn)比保護(hù)神經(jīng)元本身更重要。以上證據(jù)充分證明神經(jīng)炎癥作為帕金森病的一大發(fā)病機(jī)理,小膠質(zhì)細(xì)胞的激活和釋放炎癥介質(zhì)起到關(guān)鍵的作用。根據(jù)國(guó)外最新研究理論推斷,TLR4可能是神經(jīng)炎癥觸發(fā)通路的關(guān)鍵受體。那么我們可以設(shè)想抑制TLR4的表達(dá),是否可以抑制小膠質(zhì)細(xì)胞活化和后續(xù)的炎癥介質(zhì)的釋放,從而阻斷PD的發(fā)生或發(fā)展呢?基于這個(gè)理論,我們?cè)O(shè)計(jì)在帕金森病小鼠經(jīng)典模型中檢測(cè)TLR4、多巴胺能神經(jīng)元、小膠質(zhì)細(xì)胞的含量,并且檢測(cè)相關(guān)的炎癥介質(zhì)如TNF-α和IL1β等的表達(dá)量,通過(guò)特異性TLR4的抗體抑制TLR4表達(dá),分析其對(duì)炎癥介質(zhì)TNF-α和IL1β等表達(dá)的影響,同時(shí)對(duì)比加用抗體組與不加抗體組小鼠行為學(xué)、黑質(zhì)紋狀體中多巴胺神經(jīng)元及小膠質(zhì)細(xì)胞激活狀態(tài)變化,最終揭示抗TLR4是否為一個(gè)關(guān)鍵的抗炎手段,對(duì)帕金森病小鼠是否有延緩病情發(fā)展和緩解癥狀的功效,同時(shí)希望明確早期檢測(cè)TLR4的活化是否對(duì)帕金森病有預(yù)測(cè)作用。第一章MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型及其評(píng)價(jià)方法的確立穩(wěn)定的帕金森動(dòng)物模型及高效的評(píng)價(jià)方法對(duì)于研究帕金森病至關(guān)重要。帕金森病的動(dòng)物模型大體分為三類(lèi)：A：毒劑誘導(dǎo)模型,B：基因模型,C：多巴胺能神經(jīng)元特異性基因敲除模型。盡管這些模型各有利弊,但因?yàn)榕两鹕』颊吲R床癥狀的復(fù)雜性,至今仍沒(méi)有哪一種模型能夠完全復(fù)制帕金森病的所有特征。臨床研究最常用的模型是1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氫吡啶(MPTP)毒劑誘導(dǎo)模型,但其評(píng)價(jià)方法各異。為了進(jìn)一步確立穩(wěn)定的動(dòng)物模型和高效的評(píng)價(jià)方法,我們將雄性C57BL/6J小鼠48只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(組1)、MPTP組(組2)和TLR4抗體+MPTP組(組3),每組各16只。組2和組3腹腔注射MPTP的劑量為30mg/Kg/次,液體注射量為10ml/Kg/次,1次/天,連續(xù)注射7天,正常對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。每次注射完畢后,觀察各組小鼠是否出現(xiàn)不自主震顫、流涎、行動(dòng)遲緩、姿勢(shì)不穩(wěn)、肢體發(fā)僵、毛發(fā)和尾巴豎起等短期癥狀。以及有無(wú)整體主動(dòng)性下降,包括進(jìn)食能力和活動(dòng)等,和運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作笨拙、彎腰弓背、前爪運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)等持續(xù)癥狀。為了讓小鼠適應(yīng)實(shí)驗(yàn)室條件,盡量避免其他因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的干擾,把小鼠于實(shí)驗(yàn)前2小時(shí)從飼養(yǎng)室移至行為學(xué)檢測(cè)室。制作帕金森病模型前2天,對(duì)小鼠行小鼠滾筒儀訓(xùn)練,以盡量減少因?qū)W習(xí)快慢的差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差的出現(xiàn)。小鼠滾筒儀是用來(lái)評(píng)價(jià)小鼠的運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力。每天訓(xùn)練測(cè)試2次,轉(zhuǎn)速為12r.min,訓(xùn)練時(shí)間120s,記錄每只小鼠從滾筒開(kāi)始旋轉(zhuǎn)到離開(kāi)滾筒的時(shí)間作為小鼠運(yùn)動(dòng)跌落潛伏期。給藥結(jié)束后1天開(kāi)始正式小鼠滾筒儀實(shí)驗(yàn)。正式實(shí)驗(yàn)時(shí)轉(zhuǎn)速調(diào)為24r.min,測(cè)試時(shí)間為360s。每只小鼠重復(fù)測(cè)定3次取平均值。所有測(cè)試完畢后每組隨機(jī)選取8只小鼠行心臟灌注固定后,取全部大腦,用于病理切片檢測(cè)各組小鼠中腦TH陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)a=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠的中腦多巴胺神經(jīng)元及小鼠滾筒儀跌落潛伏期的差異性比較：如果方差齊就采用單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni法；如果方差不齊則采用穩(wěn)健的Welch檢驗(yàn),組間多重比較采用Tamhane'T2法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)MPTP注射后2分鐘,C57BL/6J小鼠開(kāi)始顯得躁動(dòng)不安,在籠內(nèi)來(lái)回奔跑或爬高,出現(xiàn)細(xì)小靜止性震顫以及下頜呈點(diǎn)頭狀震顫、立毛反應(yīng)等。大約10分鐘后開(kāi)始蜷縮成團(tuán),出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)減少,此時(shí)皮毛散亂,目光呆滯,豎毛、弓背、豎尾明顯,對(duì)外界刺激反應(yīng)降低或根本無(wú)反應(yīng)。以上急性中毒反應(yīng)大約4小時(shí)后開(kāi)始減弱,24小時(shí)后基本消失,但運(yùn)動(dòng)仍減少。從MPTP開(kāi)始注射第5天,小鼠開(kāi)始出現(xiàn)整體主動(dòng)性下降,包括進(jìn)食能力和活動(dòng)等,并且出現(xiàn)運(yùn)動(dòng)遲緩、步態(tài)不穩(wěn)、動(dòng)作笨拙、彎腰弓背、前爪運(yùn)動(dòng)不協(xié)調(diào)等持續(xù)癥狀�？陀^定量檢測(cè)運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力發(fā)現(xiàn)對(duì)照組小鼠的跌落潛伏期明顯比其他各組長(zhǎng),MPTP組小鼠跌落潛伏期最短,Anti-TLR4+MPTP組次之,三組之間比較有顯著性差異(F=970.707,P0.001)。說(shuō)明MPTP誘導(dǎo)的帕金森病小鼠模型運(yùn)動(dòng)協(xié)調(diào)能力明顯受損。三組中腦TH陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=97.406,P0.001),各組兩兩比較差異有顯著性(P=0.001)。MPTP組小鼠中腦黑質(zhì)TH陽(yáng)性多巴胺能神經(jīng)元數(shù)量明顯比正常對(duì)照組減少。用高倍鏡觀察,可見(jiàn)多巴胺能神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量少,細(xì)胞體積小,細(xì)胞質(zhì)染色變淺,神經(jīng)突起變短。根據(jù)本研究我們得出結(jié)論：MPTP誘導(dǎo)的帕金森亞急性小鼠模型臨床表現(xiàn)與帕金森病患者相似,免疫組化顯示明顯的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失,符合帕金森動(dòng)物模型的要求。小鼠滾筒儀測(cè)試可以較客觀評(píng)價(jià)帕金森動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)癥狀。第二章帕金森病小鼠模型TH、TLR4、CDllb和炎癥介質(zhì)的表達(dá)及TLR4抗體對(duì)其表達(dá)的影響為了進(jìn)一步驗(yàn)證TLR4受體在帕金森病小鼠發(fā)病過(guò)程中的作用及其抗體對(duì)TH、TLR4、CDllb和炎癥介質(zhì)表達(dá)的影響,我們?nèi)园凑盏谝徊糠謱?shí)驗(yàn)方案將雄性C57BL/6J小鼠48只,隨機(jī)分為正常對(duì)照組(組1)、MPTP組(組2)和TLR4抗體+MPTP組(組3),每組各16只。組2和組3腹腔注射MPTP的劑量為30mg/Kg/次,液體注射量為10ml/Kg/次,1次/天,連續(xù)注射7天,正常對(duì)照組注射等體積的生理鹽水。由于血腦屏障的客觀存在,所以給予小鼠TLR4抗體也要考慮是否能夠通過(guò)血腦屏障的問(wèn)題。鑒于目前的觀點(diǎn)認(rèn)為通過(guò)鼻飼或側(cè)腦室給藥是兩個(gè)容易通過(guò)血腦屏障的簡(jiǎn)單方法,盡管從大量文獻(xiàn)可以看出經(jīng)鼻腔給藥對(duì)到達(dá)腦內(nèi)的藥物濃度不能充分保證,但我們還是根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道進(jìn)行了上述兩種方法的預(yù)實(shí)驗(yàn),并使用In-Vivo FX PRO全自動(dòng)臨床前小動(dòng)物成像系統(tǒng)對(duì)小鼠進(jìn)行檢測(cè),以確認(rèn)兩種給藥途徑的穩(wěn)定性及有效性。從小鼠活體成像結(jié)果可以發(fā)現(xiàn),C57BL/6J小鼠經(jīng)鼻飼Anti-Mouse CD284(TLR4)PE后側(cè)腦室基本無(wú)紅色熒光,說(shuō)明經(jīng)鼻腔給藥方式效果差,不能保證有效藥物濃度；而C57BL/6J小鼠經(jīng)頭部右側(cè)側(cè)腦室注射Anti-Mouse CD284(TLR4)PE后雙側(cè)側(cè)腦室有紅色熒光,再次證實(shí)側(cè)腦室給藥能夠保證達(dá)到中樞神經(jīng)系統(tǒng)的有效藥物濃度,并且注射后小鼠很快恢復(fù)正常,對(duì)小鼠沒(méi)有明顯的急性損傷反應(yīng)而且操作方便,實(shí)用性好,所以我們選擇了側(cè)腦室注射TLR4抗體。組3的C57BL/6J小鼠于注射MPTP前2天開(kāi)始每天經(jīng)一側(cè)腦室注射TLR4單克隆抗體20ug/只,連續(xù)2天,組1和組2注射等體積的生理鹽水。制作PD模型前2天對(duì)小鼠行小鼠滾筒儀訓(xùn)練,以盡量減少因?qū)W習(xí)快慢的差異導(dǎo)致實(shí)驗(yàn)誤差的出現(xiàn)。在第8天,所有小鼠進(jìn)行小鼠滾筒儀行為學(xué)測(cè)試,結(jié)束后,每組小鼠隨機(jī)選取8只斷頭取腦,快速于冰上取中腦新鮮腦組織用來(lái)檢測(cè)TLR4、TNFa和IL1β的mRNA表達(dá)水平。剩下的每組8只小鼠行心臟灌注固定后,取全部大腦組織,用于免疫組化檢測(cè)各組小鼠中腦TLR4、TH和CD11b陽(yáng)性細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量。所有數(shù)據(jù)采用SPSS 16.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件處理,計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05,P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。各組小鼠的中腦多巴胺神經(jīng)元、CD11b含量、中腦腹側(cè)部TLR4mRNA、TNFamRNA、IL1βmRNA表達(dá)量及小鼠滾筒儀跌落潛伏期等的差異性比較：如果方差齊就采用單因素方差分析,組間多重比較采用Bonferroni法；如果方差不齊則采用穩(wěn)健的Welch檢驗(yàn),組間多重比較采用Tamhane'T2法。結(jié)果發(fā)現(xiàn)三組中腦TH陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元含量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=97.406,P0.001),各組兩兩比較均有顯著性差異(P=0.001)。對(duì)照組明顯增高,TLR4抗體+MPTP組次之,MPTP組中腦TH陽(yáng)性多巴胺神經(jīng)元數(shù)量最少,說(shuō)明帕金森病小鼠模型造模成功,TLR4抗體干預(yù)有效。三組中腦CD11b陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異顯著,有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=131.856,P0.001),各組兩兩比較均有顯著性差異(P.001)。MPTP組明顯增高,TLR4抗體+MPTP組次之,對(duì)照組中腦CD11b陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最少。說(shuō)明MPTP誘導(dǎo)了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,而TLR4抗體能夠部分減少這種活化。三組中腦TLR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=331.758,P0.001),各組兩兩比較均有顯著性差異(P0.001).MPTP組明顯增高,TLR4抗體+MPTP組次之,對(duì)照組中腦TLR4陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量最少。三組中腦TLR4mRNA、TNFamRNA和IL1βmRNA表達(dá)量差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(分別為F=36.385, P0.001; F=299.599, P0.001; F=40.191, P0.001), TLR4mRNA和IL1βmRNA表達(dá)量各組之間兩兩比較均有顯著性差異(P0.01), TNFamRNA表達(dá)量各組之間兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),均表現(xiàn)為MPTP組明顯增高,TLR4抗體+MPTP組次之,對(duì)照組最低。說(shuō)明MPTP誘導(dǎo)了下游促炎癥因子的大量釋放,并且TLR4參與了這一病理過(guò)程,TLR4抗體能夠減少這種促炎癥因子的釋放。因此我們得出結(jié)論：TLR4可能是神經(jīng)變性疾病神經(jīng)炎癥觸發(fā)通路的關(guān)鍵受體,TLR4受體觸發(fā)了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并誘導(dǎo)了下游促炎癥因子的釋放,最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的死亡；通過(guò)特異性TLR4抗體可以部分阻斷MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過(guò)程,降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減少促炎癥因子TNFa、IL-1β的表達(dá),減少多巴胺能神經(jīng)元的死亡,從而部分緩解帕金森小鼠模型的行為學(xué)異常；由于我們的研究樣本量偏小,還需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本進(jìn)行多中心研究,以揭示TLR4通路的藥理調(diào)節(jié)是否成為一個(gè)全新的帕金森病治療手段�？傊�,本研究發(fā)現(xiàn)MPTP誘導(dǎo)的帕金森病亞急性小鼠模型臨床表現(xiàn)與帕金森病患者相似,免疫組化顯示明顯的黑質(zhì)區(qū)多巴胺能神經(jīng)元丟失,符合帕金森病動(dòng)物模型的要求。小鼠滾筒儀測(cè)試可以較客觀評(píng)價(jià)帕金森病動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)癥狀。TLR4可能是神經(jīng)變性疾病神經(jīng)炎癥觸發(fā)通路的關(guān)鍵受體,TLR4受體觸發(fā)了小膠質(zhì)細(xì)胞的活化并誘導(dǎo)了下游促炎癥因子的釋放,最終導(dǎo)致多巴胺能神經(jīng)元的死亡。通過(guò)特異性TLR4抗體可以部分阻斷MPTP誘導(dǎo)的神經(jīng)炎癥過(guò)程,降低小膠質(zhì)細(xì)胞的活化,減少促炎癥因子TNFα、IL-1β的表達(dá),減少多巴胺能神經(jīng)元的死亡,從而部分緩解帕金森小鼠模型的行為學(xué)異常。更多的研究將揭示TLR4通路的藥理調(diào)節(jié)是否成為一個(gè)全新的帕金森病治療手段。
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【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類(lèi)號(hào)】：R742.5
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本文編號(hào)：1551697