本文關鍵詞： 膠質瘤 氯化兩面針堿 橄欖苦苷 AKT 凋亡 侵襲　出處：《山東大學》2016年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景惡性膠質瘤,包括間變型星形細胞瘤(Anaplastic astrocytoma AA),膠質肉瘤(gliasarcoma)和多形性膠質母細胞瘤(glioblastoma multiforme GBM),起源于中樞神經系統(tǒng)的膠質細胞,是顱內最常見的惡性腫瘤。盡管這些腫瘤僅占成人全部腫瘤的2%,但他們仍然是腫瘤導致死亡的第4大原因,嚴重威脅人類健康。以GBM為例,男性多見,男女比例為1.6：1,平均生存期為14.6個月。目前主要治療方式為手術切除+放療+化療,但由于惡性膠質瘤生長快,侵襲性強,即使手術后輔助放療和化療,患者的遠期生存期也并沒有明顯增長。過去一段時間,不斷出現(xiàn)治療膠質瘤的新思路、新理念,新方法,但這些在臨床上并未獲得顯著成功。凋亡和侵襲與膠質瘤發(fā)生發(fā)展的過程密切相關。有研究提示,在膠質瘤發(fā)展過程中,凋亡減少所起到的作用甚至要大于細胞快速增殖所起到的作用,細胞凋亡功能的異常有可能在膠質瘤的發(fā)展中起主導作用。大量證據(jù)已經證實,不同的凋亡通路在膠質瘤進展過程中被激活,此過程涉及諸多凋亡相關分子,如Bcl-2、Bax、casepase-3、casepase-9、Cyto-C、P53、Survival等。而且,這些分子的表達有些與膠質瘤的惡性程度呈正相關,對判斷患者的預后有著重要意義。Bcl-2和Bax同屬Bcl-2家族,Bcl-2有抗凋亡作用而Bax有促凋亡作用。P53是一個與凋亡有關的抑癌基因,野生型P53主要通過上調Bax的基因轉錄來間接促進細胞的凋亡�？梢姷蛲雠c膠質瘤的發(fā)生有著非常密切的關系。目前有人提出膠質瘤化療的新理念,即怎樣更有效的誘導腫瘤細胞的凋亡。所以,通過不斷深入研究膠質瘤凋亡的機制,找到正確的靶點或者有效藥物促進膠質瘤細胞的凋亡過程,將為膠質瘤的治療提供革命性的創(chuàng)新。同時,膠質瘤的不斷擴散與其強大的侵襲性密不可分。尸檢報告,45%GBM的生長范圍超過一個腦葉,25%侵及整個大腦半球,25-30%的腫瘤可以侵犯到對側半球。膠質瘤的擴散類型包括鄰近部位擴散、遠處復發(fā)、多發(fā)性膠質瘤,其主要擴散途徑還是沿白質鄰近擴散侵犯附近的腦實質。而從微觀結構上分析,膠質瘤細胞的侵襲性是破壞了細胞外基質分子和細胞面表面的粘附分子。膠質瘤細胞侵襲的主要執(zhí)行者是基質金屬蛋白酶家族(MMPs),尤其是MMP2和MMP9,能夠降解多種細胞外基質成份,破壞正常腦實質的組織學屏障,因此本課題試圖尋找有效藥物來抑制MMP2和MMP9的活性或者減少兩者的表達,從而減弱或阻斷膠質瘤的侵襲。目前,臨床上還沒有專門促進膠質瘤細胞凋亡和控制其侵襲力的藥物,主要化療藥物還是以替莫唑胺(TMZ)為主,利用細胞毒性發(fā)揮其藥理作用,不良反應小,但價錢昂貴,加上患者耐藥性的增加,所以尋找更好的化療藥物顯得尤為重要。如今,關于中醫(yī)藥的研究得到不斷發(fā)展,很多臨床證據(jù)證實,某些中醫(yī)藥對腦膠質瘤的發(fā)展具有很強的抑制作用。氯化兩面針堿(Nitidine chloride)是一種天然活性成分,大量研究表明它能夠抑制多種腫瘤的惡性生物學行為,而且AKT、ERK等信號轉導通路在NC抑制腫瘤細胞的生長過程中起到重要作用。但目前氯化兩面針堿對膠質瘤細胞發(fā)生發(fā)展的研究尚未報道,關于其發(fā)揮抗癌作用所涉及的信號通路也尚不明確,所以本課題將探討NC對膠質瘤的作用,并對作用機制做相應探索。橄欖苦苷(Oleuropein)也是一種天然活性成分,主要從橄欖葉中提取而成,據(jù)相關文獻報道,它在很多腫瘤中表現(xiàn)出抗癌作用,其發(fā)生作用的關鍵細胞信號通路包括MAPK、PI3K等。然而,關于橄欖苦苷對人膠質瘤的作用及相關機制至今甚少報道。本課題的第二部分就橄欖苦苷對膠質瘤細胞發(fā)展過程的影響進行檢測,并對其作用機制做進一步研究。本課題重點研究兩面針堿和橄欖苦苷對膠質瘤的作用,并探索這兩種藥物發(fā)揮作用的相應機制,為膠質瘤的藥物治療拓寬新道路。目的1.氯化兩面針堿抑制腦膠質瘤細胞的生長：(1)檢測氯化兩面針堿對膠質瘤細胞活性和增殖的影響。(2)檢測氯化兩面針堿對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響。(3)檢測氯化兩面針堿對膠質瘤細胞線粒體膜電位、線粒體形態(tài)、乳酸和ATP生成量的影響。(4)探討氯化兩面針堿對膠質瘤細胞PI3K/AKT/mTOR通路的作用。2.橄欖苦苷抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲：(1)檢測橄欖苦苷對膠質瘤細胞活性和增殖的影響。(2)檢測橄欖苦苷對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響。(3)檢測橄欖苦苷對膠質瘤細胞凋亡的影響。(4)探索橄欖苦苷對AKT、P38、ERK、JNK通路的作用。(5)探索橄欖苦苷對AKT通路下游分子(P53、Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-9、 MMP-3和MMP9)的作用。方法1.NC抑制腦膠質瘤細胞的生長(U87和U251膠質瘤細胞作為研究對象)：(1)CCK-8和EdU實驗檢測NC對膠質瘤細胞增殖的影響。(2)劃痕和Transwell試驗檢測NC對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響。(3)JC-1探針法檢測NC對膠質瘤細胞線粒體膜電位的影響；應用Mitotracer探針檢測NC對線粒體形態(tài)的影響：應用試劑盒檢測NC對膠質瘤細胞ATP及乳酸生成的影響。(4) Western-Blot技術檢測膠質瘤細胞中與凋亡過程有關蛋白分子和DRP-1、 Mfn-z表達水平,探討NC對膠質瘤PI3K/AKT/mTOR通路及下游有關分子的關系。(5)以四周齡的BALB/c裸鼠為研究對象,將100μL細胞液(含有1×107熒光素酶標記的U87細胞)注射到小鼠右側大腦額葉并將小鼠隨機分成兩組：實驗組和對照組,每組5只,口服藥物500mg/kg/day,每周5次,連續(xù)4周,對照組給予生理鹽水。每14天應用小動物活體成像系統(tǒng)測量腫瘤體積。記錄兩組小鼠生存時間。2.橄欖苦苷通過抑制AKT通路的活性抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲(A172和U251膠質瘤細胞為研究對象)：(1)CCK-8實驗方法檢測橄欖苦苷對膠質瘤細胞增殖的影響。(2)劃痕和Transwell試驗檢測橄欖苦苷對膠質瘤細胞遷移和侵襲的影響。(3)流式細胞技術研究橄欖苦苷對細胞凋亡的影響。(4) Western-Blot技術檢測Oleuropein對膠質瘤細胞內AKT、P38、ERK、JNK通路及下游分子(P53、Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-9、MMP-3和MMP9)的作用。結果1.氯化兩面針堿抑制腦膠質瘤細胞的生長：(1)CCK-8結果顯示：氯化兩面針堿能夠明顯抑制U251和U87細胞增殖,與藥物濃度呈正相關。(2)劃痕和Transwell試驗結果顯示：氯化兩面針堿能夠明顯抑制U251和U87細胞的遷移和侵襲。(3)線粒體膜電位實驗結果顯示：氯化兩面針堿能夠使膠質瘤細胞線粒體膜電位降低：免疫熒光素染色結果顯示氯化兩面針堿對線粒體形態(tài)產生影響,線粒體融合現(xiàn)象減少,而分裂情況增加；氯化兩面針堿能夠降低膠質瘤細胞ATP及乳酸的生成。(4) Western-Blot結果顯示：氯化兩面針堿能夠明顯抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性,同時Bax和Cyto-C的表達明顯上調,而Bcl-2的表達下調,說明氯化兩面針堿可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性來對膠質瘤細胞的生長產生影響。(5)小鼠原位植瘤實驗驗證了氯化兩面針堿對膠質瘤細胞的抑制作用,腫瘤細胞的生長速度和腫瘤體積都受到明顯抑制。實驗組小鼠生存時間較對照組明顯增長。2.橄欖苦苷通過抑制AKT通路的活性抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲(1)CCK-8結果顯示：橄欖苦苷能夠明顯抑制U251和A172細胞增殖,并且與藥物濃度正相關。(2)劃痕和Transwell試驗結果顯示：橄欖苦苷對U251和A172細胞的遷移和侵襲能力產生抑制作用。(3)流式細胞技術顯示：U251和A172細胞的凋亡數(shù)明顯升高。(4) Western-Blot技術證實,橄欖苦苷治療后p-AKT的表達水平降低,而P38、 ERK、JNK通路的活化水平未見明顯改變,而且能夠下調MMP2,MMP9的表達,另一方面上調Bax的表達和下調Bcl-2的表達。結論1.氯化兩面針堿能夠抑制膠質瘤細胞生長,對膠質瘤細胞的代謝產生影響,并且通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性,影響其下游Bax, Bcl-2,及Cyto-C的表達。2.橄欖苦苷能夠抑制膠質瘤細胞的增殖和侵襲,在機制上,橄欖苦苷通過AKT信號通路促進膠質瘤細胞的凋亡,從而抑制膠質瘤細胞的增殖；另一方面,橄欖苦苷作用后的MMP2, MMP9的表達水平降低,有效抑制了膠質瘤細胞的遷移和侵襲能力。
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【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

【參考文獻】

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1 徐高峰;白曉斌;王茂德;謝萬福;李瑞春;李傳坤;;腦膠質瘤細胞糖酵解表型特征及對細胞增殖與凋亡的影響[J];南方醫(yī)科大學學報;2013年03期

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本文編號：1542600