本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 氯化兩面針堿 橄欖苦苷 AKT 凋亡 侵襲　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景惡性膠質(zhì)瘤,包括間變型星形細(xì)胞瘤(Anaplastic astrocytoma AA),膠質(zhì)肉瘤(gliasarcoma)和多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(glioblastoma multiforme GBM),起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的膠質(zhì)細(xì)胞,是顱內(nèi)最常見的惡性腫瘤。盡管這些腫瘤僅占成人全部腫瘤的2%,但他們?nèi)匀皇悄[瘤導(dǎo)致死亡的第4大原因,嚴(yán)重威脅人類健康。以GBM為例,男性多見,男女比例為1.6：1,平均生存期為14.6個(gè)月。目前主要治療方式為手術(shù)切除+放療+化療,但由于惡性膠質(zhì)瘤生長快,侵襲性強(qiáng),即使手術(shù)后輔助放療和化療,患者的遠(yuǎn)期生存期也并沒有明顯增長。過去一段時(shí)間,不斷出現(xiàn)治療膠質(zhì)瘤的新思路、新理念,新方法,但這些在臨床上并未獲得顯著成功。凋亡和侵襲與膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的過程密切相關(guān)。有研究提示,在膠質(zhì)瘤發(fā)展過程中,凋亡減少所起到的作用甚至要大于細(xì)胞快速增殖所起到的作用,細(xì)胞凋亡功能的異常有可能在膠質(zhì)瘤的發(fā)展中起主導(dǎo)作用。大量證據(jù)已經(jīng)證實(shí),不同的凋亡通路在膠質(zhì)瘤進(jìn)展過程中被激活,此過程涉及諸多凋亡相關(guān)分子,如Bcl-2、Bax、casepase-3、casepase-9、Cyto-C、P53、Survival等。而且,這些分子的表達(dá)有些與膠質(zhì)瘤的惡性程度呈正相關(guān),對(duì)判斷患者的預(yù)后有著重要意義。Bcl-2和Bax同屬Bcl-2家族,Bcl-2有抗凋亡作用而Bax有促凋亡作用。P53是一個(gè)與凋亡有關(guān)的抑癌基因,野生型P53主要通過上調(diào)Bax的基因轉(zhuǎn)錄來間接促進(jìn)細(xì)胞的凋亡�？梢姷蛲雠c膠質(zhì)瘤的發(fā)生有著非常密切的關(guān)系。目前有人提出膠質(zhì)瘤化療的新理念,即怎樣更有效的誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡。所以,通過不斷深入研究膠質(zhì)瘤凋亡的機(jī)制,找到正確的靶點(diǎn)或者有效藥物促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡過程,將為膠質(zhì)瘤的治療提供革命性的創(chuàng)新。同時(shí),膠質(zhì)瘤的不斷擴(kuò)散與其強(qiáng)大的侵襲性密不可分。尸檢報(bào)告,45%GBM的生長范圍超過一個(gè)腦葉,25%侵及整個(gè)大腦半球,25-30%的腫瘤可以侵犯到對(duì)側(cè)半球。膠質(zhì)瘤的擴(kuò)散類型包括鄰近部位擴(kuò)散、遠(yuǎn)處復(fù)發(fā)、多發(fā)性膠質(zhì)瘤,其主要擴(kuò)散途徑還是沿白質(zhì)鄰近擴(kuò)散侵犯附近的腦實(shí)質(zhì)。而從微觀結(jié)構(gòu)上分析,膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲性是破壞了細(xì)胞外基質(zhì)分子和細(xì)胞面表面的粘附分子。膠質(zhì)瘤細(xì)胞侵襲的主要執(zhí)行者是基質(zhì)金屬蛋白酶家族(MMPs),尤其是MMP2和MMP9,能夠降解多種細(xì)胞外基質(zhì)成份,破壞正常腦實(shí)質(zhì)的組織學(xué)屏障,因此本課題試圖尋找有效藥物來抑制MMP2和MMP9的活性或者減少兩者的表達(dá),從而減弱或阻斷膠質(zhì)瘤的侵襲。目前,臨床上還沒有專門促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡和控制其侵襲力的藥物,主要化療藥物還是以替莫唑胺(TMZ)為主,利用細(xì)胞毒性發(fā)揮其藥理作用,不良反應(yīng)小,但價(jià)錢昂貴,加上患者耐藥性的增加,所以尋找更好的化療藥物顯得尤為重要。如今,關(guān)于中醫(yī)藥的研究得到不斷發(fā)展,很多臨床證據(jù)證實(shí),某些中醫(yī)藥對(duì)腦膠質(zhì)瘤的發(fā)展具有很強(qiáng)的抑制作用。氯化兩面針堿(Nitidine chloride)是一種天然活性成分,大量研究表明它能夠抑制多種腫瘤的惡性生物學(xué)行為,而且AKT、ERK等信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在NC抑制腫瘤細(xì)胞的生長過程中起到重要作用。但目前氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)生發(fā)展的研究尚未報(bào)道,關(guān)于其發(fā)揮抗癌作用所涉及的信號(hào)通路也尚不明確,所以本課題將探討NC對(duì)膠質(zhì)瘤的作用,并對(duì)作用機(jī)制做相應(yīng)探索。橄欖苦苷(Oleuropein)也是一種天然活性成分,主要從橄欖葉中提取而成,據(jù)相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道,它在很多腫瘤中表現(xiàn)出抗癌作用,其發(fā)生作用的關(guān)鍵細(xì)胞信號(hào)通路包括MAPK、PI3K等。然而,關(guān)于橄欖苦苷對(duì)人膠質(zhì)瘤的作用及相關(guān)機(jī)制至今甚少報(bào)道。本課題的第二部分就橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞發(fā)展過程的影響進(jìn)行檢測,并對(duì)其作用機(jī)制做進(jìn)一步研究。本課題重點(diǎn)研究兩面針堿和橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤的作用,并探索這兩種藥物發(fā)揮作用的相應(yīng)機(jī)制,為膠質(zhì)瘤的藥物治療拓寬新道路。目的1.氯化兩面針堿抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長：(1)檢測氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性和增殖的影響。(2)檢測氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3)檢測氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位、線粒體形態(tài)、乳酸和ATP生成量的影響。(4)探討氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞PI3K/AKT/mTOR通路的作用。2.橄欖苦苷抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲：(1)檢測橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞活性和增殖的影響。(2)檢測橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3)檢測橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。(4)探索橄欖苦苷對(duì)AKT、P38、ERK、JNK通路的作用。(5)探索橄欖苦苷對(duì)AKT通路下游分子(P53、Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-9、 MMP-3和MMP9)的作用。方法1.NC抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長(U87和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞作為研究對(duì)象)：(1)CCK-8和EdU實(shí)驗(yàn)檢測NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。(2)劃痕和Transwell試驗(yàn)檢測NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3)JC-1探針法檢測NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位的影響；應(yīng)用Mitotracer探針檢測NC對(duì)線粒體形態(tài)的影響：應(yīng)用試劑盒檢測NC對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATP及乳酸生成的影響。(4) Western-Blot技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細(xì)胞中與凋亡過程有關(guān)蛋白分子和DRP-1、 Mfn-z表達(dá)水平,探討NC對(duì)膠質(zhì)瘤PI3K/AKT/mTOR通路及下游有關(guān)分子的關(guān)系。(5)以四周齡的BALB/c裸鼠為研究對(duì)象,將100μL細(xì)胞液(含有1×107熒光素酶標(biāo)記的U87細(xì)胞)注射到小鼠右側(cè)大腦額葉并將小鼠隨機(jī)分成兩組：實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組,每組5只,口服藥物500mg/kg/day,每周5次,連續(xù)4周,對(duì)照組給予生理鹽水。每14天應(yīng)用小動(dòng)物活體成像系統(tǒng)測量腫瘤體積。記錄兩組小鼠生存時(shí)間。2.橄欖苦苷通過抑制AKT通路的活性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲(A172和U251膠質(zhì)瘤細(xì)胞為研究對(duì)象)：(1)CCK-8實(shí)驗(yàn)方法檢測橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖的影響。(2)劃痕和Transwell試驗(yàn)檢測橄欖苦苷對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞遷移和侵襲的影響。(3)流式細(xì)胞技術(shù)研究橄欖苦苷對(duì)細(xì)胞凋亡的影響。(4) Western-Blot技術(shù)檢測Oleuropein對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞內(nèi)AKT、P38、ERK、JNK通路及下游分子(P53、Bax、Bcl-2、Cas-3、Cas-9、MMP-3和MMP9)的作用。結(jié)果1.氯化兩面針堿抑制腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長：(1)CCK-8結(jié)果顯示：氯化兩面針堿能夠明顯抑制U251和U87細(xì)胞增殖,與藥物濃度呈正相關(guān)。(2)劃痕和Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示：氯化兩面針堿能夠明顯抑制U251和U87細(xì)胞的遷移和侵襲。(3)線粒體膜電位實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：氯化兩面針堿能夠使膠質(zhì)瘤細(xì)胞線粒體膜電位降低：免疫熒光素染色結(jié)果顯示氯化兩面針堿對(duì)線粒體形態(tài)產(chǎn)生影響,線粒體融合現(xiàn)象減少,而分裂情況增加；氯化兩面針堿能夠降低膠質(zhì)瘤細(xì)胞ATP及乳酸的生成。(4) Western-Blot結(jié)果顯示：氯化兩面針堿能夠明顯抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性,同時(shí)Bax和Cyto-C的表達(dá)明顯上調(diào),而Bcl-2的表達(dá)下調(diào),說明氯化兩面針堿可能通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性來對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生長產(chǎn)生影響。(5)小鼠原位植瘤實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了氯化兩面針堿對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制作用,腫瘤細(xì)胞的生長速度和腫瘤體積都受到明顯抑制。實(shí)驗(yàn)組小鼠生存時(shí)間較對(duì)照組明顯增長。2.橄欖苦苷通過抑制AKT通路的活性抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲(1)CCK-8結(jié)果顯示：橄欖苦苷能夠明顯抑制U251和A172細(xì)胞增殖,并且與藥物濃度正相關(guān)。(2)劃痕和Transwell試驗(yàn)結(jié)果顯示：橄欖苦苷對(duì)U251和A172細(xì)胞的遷移和侵襲能力產(chǎn)生抑制作用。(3)流式細(xì)胞技術(shù)顯示：U251和A172細(xì)胞的凋亡數(shù)明顯升高。(4) Western-Blot技術(shù)證實(shí),橄欖苦苷治療后p-AKT的表達(dá)水平降低,而P38、 ERK、JNK通路的活化水平未見明顯改變,而且能夠下調(diào)MMP2,MMP9的表達(dá),另一方面上調(diào)Bax的表達(dá)和下調(diào)Bcl-2的表達(dá)。結(jié)論1.氯化兩面針堿能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞生長,對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的代謝產(chǎn)生影響,并且通過抑制PI3K/AKT/mTOR通路的活性,影響其下游Bax, Bcl-2,及Cyto-C的表達(dá)。2.橄欖苦苷能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖和侵襲,在機(jī)制上,橄欖苦苷通過AKT信號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡,從而抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖；另一方面,橄欖苦苷作用后的MMP2, MMP9的表達(dá)水平降低,有效抑制了膠質(zhì)瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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1 徐高峰;白曉斌;王茂德;謝萬福;李瑞春;李傳坤;;腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞糖酵解表型特征及對(duì)細(xì)胞增殖與凋亡的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2013年03期

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本文編號(hào)：1542600