本文關(guān)鍵詞： 缺血再灌注后腦損傷 延遲性神經(jīng)元死亡 自噬 GEF-H1 神經(jīng)元可塑性　出處：《吉林大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：缺血性腦血管病是嚴重影響人類健康的主要疾病，其發(fā)生原因主要是由于血管重度狹窄或堵塞導(dǎo)致的腦組織血液供應(yīng)不足。目前，臨床上多選擇頸內(nèi)動脈內(nèi)膜剝脫術(shù)、血管內(nèi)支架置入術(shù)及顱內(nèi)外血管搭橋術(shù)等方法恢復(fù)缺血腦區(qū)的血液供應(yīng)，但是再灌注性腦損傷已經(jīng)成為影響缺血性腦血管病療效的主要因素之一。所以，探討缺血再灌注性腦損傷的發(fā)生機制以及防治措施對提高缺血性腦血管病的治療效果具有積極的意義。在本研究中，我們從“神經(jīng)元”及“突觸聯(lián)系”兩個方面探討了缺血再灌注性腦損傷的發(fā)生機制及潛在的防治措施。主要做了三部分實驗，分別研究了自噬對缺血再灌注神經(jīng)元損傷的影響，以及人參皂甙Rb1的干預(yù)作用和機制；人參皂甙Rb1的保護作用與PI3K/Akt信號通路的關(guān)系；以及GEF-H1通路對腦缺血再灌注后神經(jīng)元可塑性功能恢復(fù)的影響。 第一部分自噬在缺血再灌注性神經(jīng)元損傷中的作用及人參皂甙Rb1的干預(yù)研究 目的：探討自噬對缺血再灌注神經(jīng)元損傷的影響及人參皂甙Rb1的干預(yù)作用和機制。方法：采用體外研究和體內(nèi)研究相結(jié)合的研究模式。體外研究采用SH-SY5Y細胞糖氧剝奪模型模擬缺血再灌注性神經(jīng)元損傷。采用MTT法測定細胞生存率、AO和MDC染色觀察自噬的發(fā)生、鋨鈾鉛染色透射電鏡觀察自噬的形成、AO染色流式細胞儀計數(shù)、蛋白印跡分析自噬相關(guān)蛋白表達。體內(nèi)研究采用雄性Wistar大鼠雙側(cè)頸總動脈夾閉結(jié)合股動脈抽血降壓法制作全腦缺血再灌注模型。采用HE染色、免疫組織化學(xué)染色、激光共聚焦顯微鏡、鋨鈾鉛染色透射電鏡、蛋白印跡分析等方法檢測自噬相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果：體外研究結(jié)果，MTT法測定結(jié)果顯示，人參皂甙Rb1處理組，細胞存活率增加；透射電鏡檢查顯示，糖氧剝奪組細胞的胞漿內(nèi)較廣泛地形成了具有雙層膜特點的自噬泡；MDC染色熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，同對照組相比較，糖氧剝奪組細胞核周圍呈斑點狀的綠色熒光強度增高，但是人參皂甙預(yù)處理組的斑點狀熒光強度顯著下降；蛋白印跡分析顯示，人參皂甙Rb1不僅抑制了糖氧剝奪所致自噬相關(guān)蛋白Becklin1和LC3的表達，還抑制了LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化。體內(nèi)研究結(jié)果，HE染色光鏡下所見15分鐘全腦缺血72小時再灌注組神經(jīng)元呈死亡神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點，人參皂甙預(yù)處理組神經(jīng)元的形態(tài)學(xué)特點介于假手術(shù)組和缺血再灌注組之間；光鏡下計數(shù)人參皂甙Rb1干預(yù)后存活率增加；透射電鏡檢查顯示，同假手術(shù)組相比較，海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的胞漿內(nèi)形成了自噬泡；LC3免疫組化染色激光共聚焦顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，再灌注24小時后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中自噬相關(guān)蛋白LC3蛋白的表達較假手術(shù)組顯著增加，但是20mg/kg和40mg/kg人參皂甙預(yù)處理顯著抑制了缺血再灌注所致LC3蛋白在海馬CA1區(qū)神經(jīng)元中的表達；蛋白印跡分析顯示，同假手術(shù)組比較，再灌注24小時后自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3I的表達顯著提高，而且LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化增多，然而20mg/kg和40mg/kg人參皂甙預(yù)處理不僅抑制了Beclin1和LC3I的表達，而且抑制了LC3I向LC3II的轉(zhuǎn)化。結(jié)論：缺血再灌注后的海馬CA1區(qū)神經(jīng)元的死亡是過度激活了自噬；人參皂甙Rb1對缺血再灌注性神經(jīng)元死亡的保護作用與其抑制自噬的過度激活有密切的關(guān)系。 第二部分人參皂甙Rb1抑制缺血再灌注后神經(jīng)元自噬性死亡中PI3K/Akt信號通路的作用 目的：探討人參皂甙Rb1抑制缺血再灌注后神經(jīng)元自噬性死亡中PI3K/Akt信號通路的作用。方法：采用體外研究和體內(nèi)研究相結(jié)合的研究模式。體外研究采用SH-SY5Y細胞糖氧剝奪模型模擬缺血再灌注性神經(jīng)元損傷。體內(nèi)研究采用雄性Wistar大鼠雙側(cè)頸總動脈夾閉結(jié)合股動脈抽血降壓法制作全腦缺血再灌注模型。采用MTT法檢測細胞增殖活力，蛋白印跡分析檢測自噬相關(guān)蛋白及PI3K/Akt信號通路相關(guān)蛋白的表達變化。結(jié)果：體外研究部分，MTT法檢測細胞增殖活力顯示，人參皂甙Rb1組細胞存活率顯著增加，LY294002+人參皂甙Rb1組的細胞存活率較人參皂甙Rb1組顯著下降；蛋白印跡分析顯示，OGD后復(fù)氧12和24小時OGD組磷酸化Akt、Beclin1和LC3II的蛋白水平較對照組均顯著升高；在人參皂甙Rb1預(yù)處理組，除外磷酸化Akt的表達水平較OGD組顯著升高，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3II的蛋白水平較OGD組均顯著下降；但是，PI3K抑制劑LY294002逆轉(zhuǎn)了由人參皂甙Rb1所調(diào)節(jié)的磷酸化Akt高表達、Beclin1和LC3II低表達的情況。體內(nèi)研究部分，HE染色光鏡下計數(shù)結(jié)果顯示，LY294002+人參皂甙Rb1組顯著低于人參皂甙Rb1組海馬CA1區(qū)存活的神經(jīng)元以及DMSO+人參皂甙Rb1組。蛋白印跡分析顯示，缺血再灌注組磷酸化Akt、Beclin1和LC3II的蛋白水平較假手術(shù)組顯著升高；人參皂甙Rb1組和DMSO+人參皂甙Rb1組的磷酸化Akt蛋白水平較缺血再灌注組顯著升高的同時，自噬相關(guān)蛋白Beclin1和LC3II的蛋白水平卻較缺血再灌注組顯著下降；但是，LY294002逆轉(zhuǎn)了由人參皂甙Rb1所調(diào)節(jié)的磷酸化Akt高表達、Beclin1和LC3II低表達的情況。結(jié)論：人參皂甙Rb1是通過激活PI3K/Akt信號通路，對缺血再灌注后海馬CA1區(qū)神經(jīng)元自噬性死亡產(chǎn)生抑制作用。 第三部分GEF-H1通路對短暫性腦缺血再灌注后神經(jīng)可塑性恢復(fù)影響的研究 目的：研究腦缺血后GEF-H1通路的變化及作用機制，為神經(jīng)元在經(jīng)受缺血損傷后的功能恢復(fù)尋找新的治療靶點。方法：本實驗首先建立Wistar大鼠的雙側(cè)血管結(jié)扎的短暫性前腦缺血（2VO）模型。于麻醉狀態(tài)下結(jié)扎雙側(cè)頸總動脈20分鐘，然后恢復(fù)血流供應(yīng)，分別選擇0.5，4，24或者72小時的再灌注時間。對不同恢復(fù)時間腦組織的組織學(xué)研究采用HE染色，Western Blotting檢測，免疫組化及共聚焦顯微鏡，電子顯微鏡，脫磷酸化以及pull-down分析等研究方法，來研究在腦缺血發(fā)生后GEF-H1通路的相關(guān)蛋白表達變化。結(jié)果：HE染色光鏡下計數(shù)結(jié)果顯示，20分鐘的腦缺血在這個模型中主要在72小時的再灌注時發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元死亡，相比較DG區(qū)，CA1區(qū)和皮層區(qū)的神經(jīng)元更容易受到損傷，皮層的神經(jīng)元也會發(fā)生遲發(fā)性神經(jīng)元壞死，盡管相對于CA1區(qū)程度更��；蛋白印跡分析顯示，總GEF-H1含量未見明顯變化，但是卻在腦缺血后從P3轉(zhuǎn)移至P1和P2部分，并從上帶轉(zhuǎn)移至下帶。CIP處理后的分析表明，GEF-H1蛋白在腦缺血發(fā)生后很有可能從神經(jīng)微管上解離并緊密合并進入了PSDs中；GEF-H1蛋白活性或是脫磷酸化作用在缺血再灌注的早期，在損傷和修復(fù)的區(qū)域同樣的發(fā)生著顯著的上升。然而，在缺血再灌注的后期，在遲發(fā)性神經(jīng)元死亡的區(qū)域，GEF-H1蛋白是下降的，但是卻在同樣經(jīng)歷了缺血損傷后存活下來的神經(jīng)元內(nèi)發(fā)生了顯著的升高。免疫組化及共聚焦顯微鏡結(jié)果顯示，在腦缺血再灌注后30分鐘和4小時，GEF-H1蛋白水平在所有大腦區(qū)域內(nèi)基本沒有改變或者只是發(fā)生了微小的下降，同時在皮層區(qū)轉(zhuǎn)移至細胞核內(nèi)。但是在24小時和72小時再灌注時間點上，與對照組相比，在易受損的CA1和一些皮層區(qū)，發(fā)生了進一步的下降，但是在抵抗腦缺血損傷能力較強的DG區(qū)，發(fā)生了明顯的增高。在72小時再灌注組中，大部分的海馬背側(cè)CA1區(qū)的神經(jīng)元發(fā)生了死亡，它們都發(fā)生了細胞核固縮并呈多角形的形態(tài)學(xué)變化；鋨鈾鉛染色透射電鏡結(jié)果表明神經(jīng)微管在腦缺血發(fā)生后發(fā)生了持續(xù)的解離，RhoApull down檢測發(fā)現(xiàn)，與對照組相比較，有活性的RhoA在腦缺血后發(fā)生了顯著性增高，而總量基本沒有變化。結(jié)論：GEF-H1在缺血再灌注后的不同時期作用不同，初始階段GEF-H1的增高可能加重神經(jīng)元損傷，，恢復(fù)階段GEF-H1蛋白的增高可以提高神經(jīng)元可塑性，促進神經(jīng)元功能恢復(fù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R743.31

【共引文獻】

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本文編號：1539045