本文關(guān)鍵詞： 脊髓性肌萎縮癥 尿液細(xì)胞 iPS細(xì)胞 直接轉(zhuǎn)分化 組蛋白脫乙酰酶抑制劑　出處：《福建醫(yī)科大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的脊髓性肌萎縮癥(spinal muscular atrophy,SMA)是一類好發(fā)于嬰幼兒和兒童期的神經(jīng)遺傳疾病,臨床上以進(jìn)行性、對(duì)稱性的肢體無力和肌肉萎縮為特征,病理上主要表現(xiàn)為選擇性脊髓前角運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的變性、壞死。目前尚無有效的治療手段,是嬰幼兒期最常見的致死性遺傳疾病之一。患者來源的神經(jīng)元或運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元標(biāo)本的缺乏是SMA發(fā)病機(jī)制和藥物干預(yù)研究的主要瓶頸。誘導(dǎo)多能干細(xì)胞(induced pluripotent stem cell,i PS)是一種由體細(xì)胞重編程后逆向分化而來的特殊類型干細(xì)胞,與胚胎干細(xì)胞類似,具有分化為三個(gè)胚層組織的能力。同時(shí),利用特異的譜系表達(dá)因子也可實(shí)現(xiàn)在不同胚層細(xì)胞之間的轉(zhuǎn)分化(direct lineage conversion)。i PS細(xì)胞技術(shù)和直接轉(zhuǎn)分化技術(shù)的出現(xiàn)為獲取SMA患者來源的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元提供了新的思路。本實(shí)驗(yàn)旨在培養(yǎng)SMA患者無創(chuàng)尿液細(xì)胞系,重編程為i PS細(xì)胞,并進(jìn)一步探索由尿液細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,結(jié)合尿液細(xì)胞和誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行組蛋白脫乙酰酶抑制劑的干預(yù)研究。方法1、收集SMA患者及對(duì)照的新鮮中段尿液,離心、沉渣培養(yǎng),對(duì)培養(yǎng)得到的尿液細(xì)胞進(jìn)行形態(tài)觀察、傳代、擴(kuò)增,建立不同表型患者的尿液細(xì)胞系,采用逆轉(zhuǎn)錄PCR、Western blot、細(xì)胞免疫熒光染色鑒定尿液細(xì)胞成分、分析尿液細(xì)胞的SMN基因缺陷及SMN蛋白的定位。2、構(gòu)建OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4慢病毒質(zhì)粒,擴(kuò)增、純化后轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞包裝病毒,以不同的病毒感染復(fù)數(shù)(MOI)感染尿液細(xì)胞,采用形態(tài)觀察、堿性磷酸酶染色、分子印跡、細(xì)胞免疫熒光染色、畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)等手段對(duì)獲得的i PS克隆進(jìn)行鑒定。3、構(gòu)建ASCL1、BRN2、MYT1L、NEUROD1、ISL1、HB9、LHX3和NGN2慢病毒質(zhì)粒,擴(kuò)增、純化后轉(zhuǎn)導(dǎo)293T細(xì)胞包裝病毒,感染尿液細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,采用形態(tài)觀察、細(xì)胞免疫熒光染色、膜片鉗等手段對(duì)誘導(dǎo)的神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定,同時(shí),對(duì)比SMA患者和健康對(duì)照的誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的差異,觀察SMA表型。4、在尿液細(xì)胞和誘導(dǎo)神經(jīng)元進(jìn)行組蛋白脫乙酰酶抑制劑丙戊酸鈉和辛二酰苯胺異羥肟酸(suberoylanilide hydroxamic acid,SAHA)的干預(yù),設(shè)置不同的濃度和觀察時(shí)間點(diǎn),對(duì)比干預(yù)前后SMN蛋白的表達(dá)量和誘導(dǎo)神經(jīng)元的生長(zhǎng)狀況及神經(jīng)元存活情況。結(jié)果1、成功建立了13例SMA患者和39例其他神經(jīng)遺傳疾病患者及健康個(gè)體的尿液細(xì)胞系。大部分的尿液細(xì)胞系由梭形和橢圓形兩種細(xì)胞類型組成,尿液細(xì)胞成分復(fù)雜,主要包括腎臟足突細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞和尿液間充質(zhì)干細(xì)胞。尿液細(xì)胞增殖能力旺盛,能穩(wěn)定擴(kuò)增6-10代。SMA患者來源的尿液細(xì)胞天然攜帶有SMN基因缺陷,在胞漿和胞核均有SMN蛋白的表達(dá),是SMA一種新的細(xì)胞模型。2、構(gòu)建了OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4的慢病毒質(zhì)粒、包裝病毒、感染尿液細(xì)胞,30天左右獲得了i PS克隆,i PS細(xì)胞表達(dá)高活性的堿性磷酸酶和胚胎干細(xì)胞標(biāo)志NANOG、SSEA3、SSEA4、Tra-1-60及Tra-1-81,并進(jìn)一步采用畸胎瘤形成實(shí)驗(yàn)證實(shí)了獲得的i PS細(xì)胞具備分化為三個(gè)胚層組織的能力。3、構(gòu)建了ASCL1、BRN2、MYT1L和NEUROD1的慢病毒質(zhì)粒、包裝病毒、感染尿液細(xì)胞和成纖維細(xì)胞,感染后15天左右可見典型的神經(jīng)元形態(tài),呈兩極或多極生長(zhǎng)、胞核居中,表達(dá)神經(jīng)元標(biāo)志Tuj-1。進(jìn)一步添加ISL1、HB9、LHX3和NGN2因子后,獲得了誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,表達(dá)HB9和CHAT標(biāo)志,檢測(cè)到細(xì)胞鈉電流和鉀電流。此外,誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元具有生長(zhǎng)、遷移活性,神經(jīng)元之間相互聯(lián)系、形成網(wǎng)絡(luò)。同時(shí),觀察到SMA患者細(xì)胞誘導(dǎo)的運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,細(xì)胞突起生長(zhǎng)速度較對(duì)照組慢、細(xì)胞存活時(shí)間也較短。4、在尿液細(xì)胞和誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元進(jìn)行組蛋白脫乙酰酶抑制劑干預(yù)后,觀察到SMN蛋白表達(dá)上調(diào),細(xì)胞核中Gems顆粒數(shù)增多,且SAHA對(duì)誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)具有一定的維持作用。結(jié)論1、尿液細(xì)胞培養(yǎng)步驟簡(jiǎn)單、尿液收集無創(chuàng)、患兒及其家屬接受程度高,是獲取和保存病人來源標(biāo)本的有效方法,尿液細(xì)胞成分復(fù)雜,主要有腎臟足突細(xì)胞、尿道上皮細(xì)胞和尿液間充質(zhì)干細(xì)胞。2、OCT4、SOX2、c-MYC和KLF4四因子能夠?qū)崿F(xiàn)尿液細(xì)胞到i PS細(xì)胞的重編程,尿液細(xì)胞來源的i PS細(xì)胞同樣具有分化為各個(gè)胚層組織的能力。3、ASCL1、BRN2、MYT1L、NEUROD1、ISL1、HB9、LHX3和NGN2八因子能夠?qū)⒛蛞杭?xì)胞和成纖維細(xì)胞直接轉(zhuǎn)分化為神經(jīng)元和運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元,獲得病人來源的神經(jīng)元模型。4、組蛋白脫乙酰酶抑制劑能夠上調(diào)SMN蛋白的表達(dá)和Gems顆粒數(shù),維持誘導(dǎo)運(yùn)動(dòng)神經(jīng)元的生長(zhǎng)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R746.4

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本文編號(hào)：1534958