本文關(guān)鍵詞： Atg5 自噬 膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells GSCs) 血管擬態(tài)(VM) 血管內(nèi)皮生長因子受體2(VEGFR-2) 三維(three dimensional 3D)培養(yǎng)　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：腫瘤生長和轉(zhuǎn)移依賴腫瘤血管新生(neovascularization)。目前有關(guān)腫瘤血管新生和發(fā)生機制的研究報道很多,抗血管生成(antiangiogenesis)治療腫瘤的新方法也得到了臨床應(yīng)用。然而,目前抗血管生成治療方法和療效有限,主要原因是對經(jīng)典血管生成途徑以外的機制認(rèn)識不足,缺乏治療策略。經(jīng)典的腫瘤血管新生途徑包括血管生成(angiogenesis)和血管發(fā)生(vasculogenesis)。近些年人們還發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞還可以通過自身變形、圍繞形成管腔,以一種獨立于內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管的血管擬態(tài)(vasculogenic mimicry,VM)方式構(gòu)筑腫瘤微循環(huán)。我們前期的研究發(fā)現(xiàn),膠質(zhì)瘤干細(xì)胞(glioma stem cells,GSCs)具有形成VM的能力,是VM形成中的關(guān)鍵細(xì)胞;VEGFR-2在介導(dǎo)GSCs形成VM中起關(guān)鍵作用。目前發(fā)現(xiàn)VM對針對VEGF的抗血管生成治療(如貝伐單抗)缺乏反應(yīng)。同時我們也觀察到,在無VEGF環(huán)境下(貝伐單抗),GSCs仍能形成管型樣結(jié)構(gòu)(VM),同時伴有VEGFR-2-Y1175位點磷酸化及自噬囊泡形成增多。這提示VM形成過程中VEGFR-2活化途徑可能存在VEGF依賴和非依賴兩種方式,自噬可能是VEGFR-2非VEGF依賴的活化途徑之一。自噬(autophagy)是細(xì)胞利用溶酶體降解自身受損的細(xì)胞器和大分子等物質(zhì)的過程,與細(xì)胞生存、生長、分化及內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定有非常重要的關(guān)系,參與生命過程的各個方面。近年自噬的研究進展對包括腫瘤在內(nèi)的許多疾病的發(fā)病機制和防治策略提出新的觀點。已有研究顯示,自噬在腫瘤中的作用復(fù)雜,且存在爭議。但目前多數(shù)學(xué)者認(rèn)為,瘤細(xì)胞在缺乏氧、營養(yǎng)及生長因子的微環(huán)境中通過形成自噬降解自身折疊錯誤的蛋白質(zhì)和受損細(xì)胞器來維持生存。目前研究顯示,VM和自噬在形成條件和機制上有相似之處。首先,VM通過瘤細(xì)胞自身變形形成,且出現(xiàn)在腫瘤快速生長、血供不足的早期及進展期的缺乏血管區(qū);同樣,瘤細(xì)胞在缺乏營養(yǎng)和氧供應(yīng)時,通過自身胞內(nèi)單層或雙層膜包裹形成自噬體,維持細(xì)胞生存。其次,自噬和VM均為基因調(diào)控下的適應(yīng)和重整微環(huán)境的過程。再次,最近有文獻報道,惡性黑色素瘤的VM形成細(xì)胞高表達自噬相關(guān)蛋白,微管相關(guān)蛋白-1輕鏈3(LC3)。提示,自噬可能參與了腫瘤VM形成。為了進一步了解自噬在VM形成中的作用和機制,以及貝伐單抗(bevacizumab,BEV)抗血管治療引起VM形成的原因,我們首先建立和驗證了新的VM的GSCs的三維(three dimensional,3D)培養(yǎng)模型,并以模型為基礎(chǔ),觀察形成VM細(xì)胞的自噬情況;通過上調(diào)和下調(diào)自噬水平,觀察對VM形成的影響;然后探討自噬調(diào)控VM形成的機制以及BEV治療GSCs引起VM增多的原因和抗自噬在其中的作用;最后檢測人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織自噬相關(guān)基因Atg5、p-VEGFR-2蛋白表達和VM形成情況及相互和預(yù)后關(guān)系。主要得到的結(jié)果和結(jié)論如下:1.體外3D支架培養(yǎng)VM模型的建立。我們將從膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87和原代膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞獲得的細(xì)胞球種植于3D膠原支架內(nèi),分別用DMEM+10%胎牛血清、干細(xì)胞培養(yǎng)基(stem cell culture medium,STM)和內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)(endothelial cells basal medium,EBM)培養(yǎng)3天后,采用HE染色、免疫熒光標(biāo)記和掃描電鏡觀察,以及蛋白印跡(western blotting,WB)實驗,結(jié)果顯示:(1)EBM誘導(dǎo)形成的管腔樣結(jié)構(gòu)高表達VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2,同時有VEGFR-2及其磷酸化表達水平的明顯升高;(2)HE染色、免疫熒光染色和掃描電鏡下發(fā)現(xiàn)僅在內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)基的培養(yǎng)下,GCSs才能形成管腔樣結(jié)構(gòu)。上述結(jié)果表明,建立的新的VM體外3D培養(yǎng)模型是很好的培養(yǎng)模型。2.自噬通過不依賴VEGF-A途徑活化VEGFR-2誘導(dǎo)GSCs形成VM。(1)GSCs轉(zhuǎn)染EGFP-LC3腺病毒后,激光共聚焦顯微鏡下觀察到瘤細(xì)胞漿內(nèi)綠色點狀的自噬體數(shù)量在EBM培養(yǎng)下顯著高于其余兩組(P0.001);WB檢測可見EBM培養(yǎng)下比其他兩組高表達自噬相關(guān)蛋白Atg7、Atg5和LC3,p62蛋白的表達水平與自噬水平呈反比,可見EBM組p62的水平較低,也說明自噬水平較高;(2)在EBM培養(yǎng)下,形成的管腔樣結(jié)構(gòu)共表達LC3和VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2;(3)自噬激動劑雷帕霉素(rapamycin,RAPA)處理的GSCs自噬體數(shù)量顯著高于對照組(P0.01);同時共聚焦顯微鏡下能觀察到RAPA組VM數(shù)量明顯高于對照組(P0.01);WB檢測可見RAPA組LC3的表達增加,p62表達下調(diào),VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2表達水平升高以及VEGFR-2和其磷酸化水平的升高;(4)自噬抑制劑氯喹(chloroquine,CQ)處理后GSCs形成的自噬體數(shù)量顯著高于對照組,P0.01,但WB檢測雖然CQ組LC3的表達上調(diào),但同時有p62水平的升高,說明細(xì)胞整體的自噬水平處于下調(diào)狀態(tài);同時在共聚焦顯微鏡下能觀察到CQ組形成VM的數(shù)量明顯低于對照組(P0.01);另可見VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2水平的下調(diào)以及VEGFR-2和其磷酸化水平的降低;(5)慢病毒敲低GSCs的Atg5基因共聚焦顯微鏡下可見shAtg5組的綠色熒光顯著減少(P0.01);VM數(shù)量sh Atg5組明顯低于對照組(P0.01);WB檢測可見VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2水平的下調(diào)以及VEGFR-2和其磷酸化水平的降低;(6)WB實驗可見BEV處理GSCs后VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2水平升高,同時有VEGFR-2和其磷酸化水平的升高和p62蛋白表達水平的下降,加入CQ后使p62蛋白表達水平升高,VE-Cadherin和Laminin B2蛋白水平以及VEGFR-2和其磷酸化水平下調(diào);shAtg5下調(diào)VEGFR-2和其磷酸化水平,而BEV引起的VEGFR-2和其磷酸化水平的上調(diào)可以被敲低Atg5所抵消;(7)激光共聚焦顯微鏡可見EBM培養(yǎng)下活性氧簇(reactive oxygen species,ROS)熒光強度較其他兩組明顯升高,當(dāng)加入CQ后ROS水平的下降,而加入雷帕霉素ROS水平升高;流式細(xì)胞術(shù)檢測見BEV誘導(dǎo)的ROS水平的上調(diào)可以被CQ降低;WB實驗可見ROS的抑制劑NAC抑制BEV誘導(dǎo)的ROS,同時降低VEGFR-2和其磷酸化水平,但p62和LC3蛋白水平?jīng)]有明顯變化。上述結(jié)果表明,自噬通過調(diào)控ROS水平來誘導(dǎo)VEGFR-2和其磷酸化水平來調(diào)控VM的生成,該過程是非依賴于VEGF-A的。BEV會誘導(dǎo)自噬水平升高和VM的生成,聯(lián)用自噬抑制劑CQ可以降低自噬及ROS水平和VM的生成。3.下調(diào)自噬水平降低貝伐單抗誘導(dǎo)的移植瘤血管擬態(tài)的形成。(1)雙染CD34+PAS示BEV可以抑制原位種植NOD/SCID小鼠移植瘤血管的生成,但VM的數(shù)量增加(P0.01),當(dāng)敲低Atg5后VM的數(shù)量不會增加;(2)CQ和BEV各自均能使NOD-SCID小鼠GSCs原位移植瘤的體積縮小,兩者共同使用更加明顯(P0.01),但BEV使VM的數(shù)量明顯增加(P0.01);CQ雖然不能降低微血管密度,卻能明顯的降低腫瘤自身產(chǎn)生的和BEV誘導(dǎo)的VM數(shù)量;免疫組化染色Atg5可見BEV治療使移植瘤細(xì)胞的Atg5表達水平上調(diào),而CQ可以明顯降低Atg5水平及其引起的VM數(shù)量(P0.01)。上述結(jié)果表明,BEV治療會誘導(dǎo)VM形成,同時Atg5表達升高。抑制自噬后能降低VM的形成,提高BEV的療效。4.人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤Atg5表達與VM形成和預(yù)后密切相關(guān)。(1)免疫熒光顯示人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織的干性標(biāo)記CD133、自噬相關(guān)蛋白LC3和VM相關(guān)蛋白VE-Cadherin和Laminin B2有共表達的現(xiàn)象,即表達CD133的細(xì)胞高表達VM相關(guān)蛋白和LC3;WB檢測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織和瘤旁組織,發(fā)現(xiàn)腫瘤組織高表達CD133和VM相關(guān)蛋白,以及自噬相關(guān)蛋白Atg7、Atg5和LC3,而p62表達水平降低,與免疫熒光的結(jié)果相一致。(2)通過Atg5+PAS雙染95例人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織,可見有VM的患者比無VM的患者在無疾病進展生存期(progression-free survival,PFS)和總生存期(overall survival,OS)均要短(均P0.001)。(3)免疫組織化學(xué)染色人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤組織Atg5,示Atg5陽性的患者比Atg5陰性的患者的PFS和OS均要短,均P0.001;并且Atg5表達與VM存在之間呈明確的相關(guān)性(r=0.6727,P0.001);(4)免疫組織化學(xué)染色p-VEGFR-2,示p-VEGFR-2陽性患者比p-VEGFR-2陰性患者的PFS和OS均要短(分別為P0.001和P0.01);并且p-VEGFR-2表達與Atg5的表達呈明顯的相關(guān)性(r=0.7743,P0.001);(5)免疫組化染色抗體EGFR、PDGFRA和p53,可將膠質(zhì)母細(xì)胞瘤分為經(jīng)典樣型(classical-like,CL)和神經(jīng)前樣型(proneural-like,PNL)兩個亞型,可見PNL亞型的PFS和OS明顯優(yōu)于CL亞型(均為P0.001);并且兩種亞型與Atg5的表達呈明顯的相關(guān)性(P=0.002)。上述結(jié)果表明,人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤有較高水平VM和自噬相關(guān)蛋白的表達,VM是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者預(yù)后不良的重要因素,Atg5和p-VEGFR-2的表達與VM形成呈明顯的正相關(guān)性,說明自噬可能是通過VEGFR-2的活化調(diào)控VM形成及導(dǎo)致臨床預(yù)后差的重要原因。并且Atg5在預(yù)后較差的CL亞型表達率比在預(yù)后較好的PNL亞型表達率高,說明Atg5不但是預(yù)后不良的指標(biāo),也是預(yù)測膠質(zhì)母細(xì)胞瘤亞型的重要線索。因此,Atg5可作為今后膠質(zhì)母細(xì)胞瘤治療的一個重要靶點。綜上所述,(1)自噬通過ROS介導(dǎo)VEGFR-2的活化促進VM的形成,該途徑是不依賴于VEGF-A的;BEV治療誘導(dǎo)VM的產(chǎn)生可通過抑制自噬而減少;(2)VM是膠質(zhì)母細(xì)胞瘤預(yù)后不良的重要因素,其與Atg5和p-VEGFR-2的表達密切相關(guān);Atg5的表達與膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的分子亞型相關(guān)。上述的研究結(jié)果為膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的抗VM治療提供了新的靶點和理論基礎(chǔ)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.41

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本文編號：1520229