本文關(guān)鍵詞： 乙酰膽堿 NK 細(xì)胞 多發(fā)性硬化 EAE CCR2~+Ly6C~(hi)單核細(xì)胞　出處：《天津醫(yī)科大學(xué)》2017年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:內(nèi)源性/外源性膽堿能抗炎系統(tǒng)在維持內(nèi)環(huán)境的免疫穩(wěn)態(tài),平衡過度的免疫炎癥反應(yīng)中起到十分重要的作用。中樞神經(jīng)系統(tǒng)自身免疫性疾病(Central nervous system autoimmune disease)的發(fā)生往往伴有外周免疫細(xì)胞的浸潤、活化,導(dǎo)致神經(jīng)髓鞘蛋白的脫失,引起多發(fā)性硬化癥(Multiple Sclerosis,MS)。尼古丁作為膽堿能受體的激動(dòng)劑,具有外源性膽堿能抗炎作用,可以有效的減少中樞神經(jīng)系統(tǒng)的免疫細(xì)胞,減輕炎癥損傷。本研究針對(duì)尼古丁的外源性膽堿能作用對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)免疫炎癥細(xì)胞的影響,對(duì)細(xì)胞發(fā)育、分化及遷移的影響進(jìn)行研究;并對(duì)以NK細(xì)胞為代表的內(nèi)源性膽堿能抗炎系統(tǒng)進(jìn)行探索,確定其隨疾病嚴(yán)重程度的改變而發(fā)生相應(yīng)變化,作為一種有效的內(nèi)源性調(diào)節(jié)因子控制疾病的進(jìn)展。這一研究將對(duì)完善膽堿能抗炎系統(tǒng)的理解和其治療機(jī)制的探索提供依據(jù)。方法:(1)通過對(duì)小鼠建立EAE模型并且皮下置入微量注射泵,研究尼古丁對(duì)EAE的臨床表現(xiàn)的影響。并且探索其對(duì)骨髓、外周及中樞的髓系免疫細(xì)胞分布和表型的影響。(2)利用流式分選或磁珠分選獲得NK細(xì)胞后,通過Western Blot和PCR確定NK細(xì)胞中是否存在膽堿能合成、轉(zhuǎn)運(yùn)及代謝的關(guān)鍵酶。膽堿乙酰轉(zhuǎn)移酶(Choline Acetyltransferase,Ch AT),膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)子(Choline Transporter,CHT1),囊泡乙酰膽堿轉(zhuǎn)運(yùn)子(Vesicular acetylcholine transporter,VACh T)以及膽堿酯酶(Acetylcholinesterase,ACh E)。(3)利用Ch AT-e GFP小鼠建立EAE動(dòng)物模型后,檢測NK細(xì)胞在EAE小鼠中Ch AT表達(dá)水平相對(duì)于正常小鼠的變化。(4)流式分選出Ch AT+NK細(xì)胞和Ch AT-NK細(xì)胞,利用基因芯片全基因組檢測后進(jìn)行富集分析。(5)通過在CX3CR1-小鼠建立EAE模型,并且向中樞回輸Ch AT+NK細(xì)胞和Ch AT-NK細(xì)胞,進(jìn)一步證實(shí)和比較Ch AT+NK細(xì)胞與Ch AT-NK細(xì)胞在CNS免疫炎癥微環(huán)境中的作用。(6)Ch AT+NK細(xì)胞和Ch AT-NK細(xì)胞回輸后對(duì)CNS免疫細(xì)胞進(jìn)行流式細(xì)胞術(shù)檢測,明確各個(gè)免疫細(xì)胞亞群的變化。(7)通過免疫熒光染色和transwell實(shí)驗(yàn)探索Ch AT+NK細(xì)胞與CCR2~+Ly6C~(hi)細(xì)胞之間的趨化和共定位。(8)免疫熒光染色探索α7n ACh R和Perforin在細(xì)胞突觸間的分布。(9)利用高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜(HPLC-MS/MS)檢測多發(fā)性硬化癥(MS)病人外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheral Blood Mononuclear Cells,PBMC)中乙酰膽堿(ACh)水平。結(jié)果:(1)在EAE模型中,外源性膽堿能受體激動(dòng)劑尼古丁可以有效的抑制中性粒細(xì)胞和CCR2~+Ly6C~(hi)單核細(xì)胞向中樞浸潤。(2)NK細(xì)胞具有完整的膽堿能系統(tǒng)合成及代謝酶,并且可以合成和分泌乙酰膽堿。(3)在EAE中NK細(xì)胞Ch AT表達(dá)增加。并且相對(duì)成熟的外周的NK細(xì)胞Ch AT表達(dá)要高于骨髓中的NK細(xì)胞。(4)NK細(xì)胞Ch AT表達(dá)與其轉(zhuǎn)移相關(guān)受體CX3CR1和介導(dǎo)免疫耐受相關(guān)的受體NKG2A表達(dá)密切相關(guān)。(5)全基因組基因芯片分析發(fā)現(xiàn)Ch AT+NK細(xì)胞相對(duì)于Ch AT-NK細(xì)胞分泌更多的細(xì)胞因子和趨化因子,更具有免疫調(diào)節(jié)功能。(6)把Ch AT+NK細(xì)胞回輸?shù)紺X3CR1-/-小鼠的CNS進(jìn)行功能驗(yàn)證更進(jìn)一步證實(shí)了其免疫調(diào)節(jié)作用,并且通過抑制殺傷CCR2~+Ly6C~(hi)細(xì)胞發(fā)揮免疫保護(hù)作用。(7)Ch AT+NK細(xì)胞與CCR2~+Ly6C~(hi)細(xì)胞可以形成免疫突觸,并且突觸中存在α7n ACh R和Perforin的極化及再分布。(8)CCR2~+Ly6C~(hi)細(xì)胞對(duì)Ch AT+NK細(xì)胞失耐受是由于Qa-1表達(dá)下調(diào),而Qa-1表達(dá)的下調(diào)可能是由于NK細(xì)胞分泌的乙酰膽堿通過α7n ACh R發(fā)揮作用。(9)在MS病人中,我們同樣發(fā)現(xiàn)病人外周血NK細(xì)胞的Ch AT表達(dá)和乙酰膽堿合成增加,并且在CD56bright NK細(xì)胞中這種上調(diào)更為顯著。結(jié)論:(1)外源性膽堿能系統(tǒng)可以通過抑制免疫細(xì)胞的浸潤而減輕中樞神經(jīng)系統(tǒng)炎癥。(2)NK細(xì)胞作為具有抑制CNS免疫炎癥作用的調(diào)節(jié)性細(xì)胞,具備合成和分泌內(nèi)源性乙酰膽堿的作用。(3)Ch AT+NK細(xì)胞作為NK細(xì)胞的一個(gè)亞群,有其特有的免疫特性,并且通過抑制CCR2~+Ly6C~(hi)單核細(xì)胞在CNS炎癥中發(fā)揮重要的免疫保護(hù)作用。(4)MS病人外周血NK細(xì)胞存在膽堿能系統(tǒng)表達(dá)的上調(diào),并且與疾病嚴(yán)重程度先關(guān),提示其在反應(yīng)疾病預(yù)后中有一定的意義。
[Abstract]:Objective : The endogenous / exogenous cholinergic anti - inflammatory system plays a very important role in maintaining the immune homeostasis of the inner environment and balancing the excessive immune inflammatory reaction . The occurrence of the central nervous system autoimmune disease is often accompanied by infiltration and activation of peripheral immune cells , which causes the loss of myelin protein and causes multiple sclerosis ( MS ) . Objective To study the effects of nicotine on immune inflammatory cells in central nervous system and to study the effect of nicotine on the distribution and phenotype of immune cells in central nervous system . ( 5 ) The expression of ChAT + NK cells and Ch AT - NK cells in peripheral blood mononuclear cells ( PBMC ) of patients with multiple sclerosis ( MS ) were detected by immunofluorescence staining and transwell experiment . ( 7 ) ChAT + NK cells and CCR2 ~ + Ly6C ~ ( hi ) cells can form an immune synaptic , and the polarization and redistribution of 偽7n - Ly6C ~ ( hi ) cells to Ch AT + NK cells are downregulated by inhibiting the infiltration of immune cells .

【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R744.51

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