本文關鍵詞： 腦缺血再灌注 能量代謝障礙 氧化應激 內質網應激 自噬 囊泡融合 p62 NSF　出處：《吉林大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：能量代謝障礙是腦缺血再灌注損傷的重要原因。腦缺血再灌注時線粒體氧化磷酸化障礙在導致ATP生成減少的同時，還產生大量的活性氧(reactive oxygenspecies，ROS)，引發(fā)氧化應激。腦缺血再灌注時，除了ATP含量減少、自由基生成增加等引起細胞損傷之外，一些適應性調控機制在腦缺血再灌注過程中的作用也引起了人們的關注。 內質網應激與自噬是細胞對損傷刺激的適應性反應。內質網應激-自噬可以維持細胞內環(huán)境的穩(wěn)態(tài)平衡，具有一定的保護性作用。內質網應激時未折疊蛋白反應可以激活自噬，自噬又可以通過降解錯誤折疊或未折疊蛋白減輕內質網的負荷，抑制內質網應激的過度激活，同時產生的降解產物也為機體細胞新蛋白質的合成、細胞結構的重建以及ATP的生成提供原料。但過度激活的內質網應激-自噬又能夠加重細胞損傷，甚至導致細胞死亡。最近的研究結果提示，內質網應激-自噬在腦缺血再灌注引起的能量代謝障礙和氧化應激過程發(fā)揮重要的作用，但其作用機制尚不十分明了。 Keap1-Nrf2-ARE信號轉導途徑是機體氧化應激條件下主要的防御機制。自噬相關蛋白p62作為一種多功能蛋白，不僅僅具有清除損傷的細胞器、降解異常聚集的蛋白等作用，而且，具有多種蛋白相互作用區(qū)的p62在細胞應激、細胞生存等多種信號轉導途徑中發(fā)揮銜接分子的作用。已有研究表明在氧化應激條件下，p62可與Nrf2之間形成一個正反饋環(huán)路，通過Keap1-Nrf2-ARE信號途徑，促進抗氧化基因的表達。因此，探討多功能蛋白p62在腦缺血再灌注損傷過程中的作用，可能進一步闡明細胞自噬與氧化應激之間的調控機制。 自噬晚期自噬體和溶酶體的融合是一個典型的囊泡融合事件。NSF，作為一種ATP酶，通過利用自身水解ATP產生的能量，介導囊泡融合完成后SNARE復合物的解離，釋放SNARE進入下一個囊泡融合進程，是囊泡融合順利進行必需的一個關鍵蛋白。體外研究表明，只有細胞質內可溶性的NSF在ATP存在條件下才能介導囊泡的融合，如果可溶性的NSF發(fā)生聚集或ATP缺失將會喪失該功能。可見，ATP產生與囊泡融合關鍵蛋白NSF的功能存在著關聯(lián)，通過復制體外細胞實驗性腦缺血再灌注模型，觀察能量代謝障礙時囊泡融合關鍵蛋白NSF的變化，進而探討腦缺血損傷過程中能量代謝障礙與細胞自噬之間可能的調控機制。 目的： 本研究基于能量代謝障礙/氧化應激在引起細胞損傷的同時，可能會激活細胞內質網應激-自噬等適應性反應，探討內質網應激-自噬在細胞能量代謝障礙與氧化應激中的作用，為闡明腦缺血再灌注損傷的機制提供新的線索。 方法： （1）體內實驗： 1）線栓法阻塞大腦中動脈復制大鼠局灶性腦缺血再灌注模型。 2）TTC染色和HE染色判斷腦缺血再灌注后腦皮質損傷情況。 3）免疫組織化學染色檢測Keap1和Nrf2的表達；免疫印跡檢測內質網應激相關蛋白、自噬相關蛋白和凋亡相關蛋白的表達、RT-PCR法檢測Keap1-Nrf2-ARE下游基因的表達。 （2）體外實驗： 1）建立體外培養(yǎng)PC12細胞ATP缺失再恢復模型；MTT法檢測細胞生存率的變化；Western Blot檢測自噬和內質網應激相關蛋白的表達。 2）建立體外培養(yǎng)CHO細胞ATP缺失再恢復模型；LDH法檢測細胞的損傷改變；差速離心和線性甘油梯度離心獲取不同蛋白組分；Western Blot檢測不同組分NSF蛋白表達。 結果： （1）體內實驗： 1）神經缺陷評分、TTC及HE染色結果表明，隨著缺血時間的延長，大鼠腦缺血再灌注引發(fā)的大腦皮質損傷逐漸加重。 2）缺血1H再灌注24h，，大腦皮質泛素化蛋白表達增加，Grp78表達升高，Bcl-2的表達升高，Bax的表達下降；隨著缺血時間的延長，至缺血3H再灌注24h，大腦皮質泛素化蛋白表達明顯增加， CHOP/GADD153表達顯著升高，Bax表達升高，Bcl-2表達下降。 3）缺血1H再灌注24h及缺血1.5H再灌注24h時，自噬共軛蛋白Atg12-Atg5和LC3-PE表達增加；在缺血3H再灌注24h，自噬共軛蛋白Atg12-Atg5和LC3-PE表達顯著下降。 4）腦缺血1H再灌注24h時，Nrf2核定位增加，上調其下游抗氧化基因NQO1、GCLM和HO1mRNA的表達。隨著缺血時間的延長，缺血3H再灌注24h時，Nrf2核定位減少，激活下游抗氧化基因NQO1和HO1的能力下降。 5）隨著缺血時間的延長，p62mRNA表達水平先增加后降低，而p62蛋白水平僅僅在缺血3H再灌注24h顯著增加。 （2）體外實驗： 1）無糖條件下輕度ATP缺失再恢復，PC12細胞生存率略有升高，此時LC3-II和p62蛋白變化不明顯；有糖條件下輕度ATP缺失再恢復，PC12細胞生存率相對于重度ATP缺失再恢復明顯升高，此時Grp78蛋白表達顯著升高，p62蛋白表達顯著下降；重度ATP缺失再恢復，PC12細胞生存率明顯下降，此時LC3-II和p62蛋白表達顯著升高；3-MA抑制自噬降低PC12細胞在ATP缺失條件下的生存率。 2）ATP缺失引起CHO細胞細胞質內可溶性NSF蛋白聚集和細胞損傷。NSF高表達可減輕ATP缺失再恢復誘導的CHO細胞損傷。 結論： 1.內質網應激-自噬途徑參與調控腦缺血再灌注損傷。短時間腦缺血后再灌注，內質網應激-自噬的激活起一定的保護性作用；長時間腦缺血后再灌注，內質網應激反應過度激活，同時機體自噬的降解能力下降，加重腦損傷。 2.腦缺血再灌注時，自噬通過p62與Keap1-Nrf2-ARE信號途徑相關聯(lián)，共同作用減輕氧化應激、抑制內質網應激的過度激活。 3.體外實驗抑制自噬能夠加重細胞損傷，提示內質網應激-自噬途徑在體外培養(yǎng)細胞能量代謝障礙過程中具有一定的細胞保護作用。 4.體外實驗發(fā)現(xiàn)，能量代謝障礙導致細胞質內可溶性的自噬相關蛋白NSF聚集失活，喪失介導囊泡融合的功能，進而可能抑制自噬降解途徑，引發(fā)細胞損傷。 綜上，我們認為腦缺血導致的腦細胞損傷與能量代謝密切相關，而適度的內質網應激-自噬在能量代謝障礙引起的細胞損傷中具有一定的保護性作用。表明腦細胞內質網應激-自噬的相關研究可能為腦缺血再灌注損傷的預防與治療提供了新的線索。
[Abstract]:Energy metabolism is an important cause of cerebral ischemia reperfusion injury. Cerebral ischemia reperfusion mitochondrial oxidative phosphorylation disorders resulting in decreased ATP generation at the same time, also produce large amounts of reactive oxygen species (reactive OXYGENSPECIES, ROS), caused by oxidative stress. Cerebral ischemia reperfusion, but reduced ATP content and increased free radical generation caused by cell damage, some adaptive mechanisms of reperfusion in the process of action also attracted the attention of people in cerebral ischemia.
Endoplasmic reticulum stress and autophagy is adaptive reaction to injury stimulation. Endoplasmic reticulum stress autophagy can maintain the homeostasis of intracellular environment, has a protective effect. The endoplasmic reticulum stress when unfolded protein response can activate autophagy, autophagy and misfolding by mistake or degradation of unfolded protein reducing Er load, inhibit excessive activation of endoplasmic reticulum stress, degradation products generated at the same time for the synthesis of new proteins in the body's cells, cell structure reconstruction and ATP production to provide raw materials. But the excessive activation of endoplasmic reticulum stress autophagy and can aggravate the injury of the cells, and even lead to cell death. Recent studies showed that energy metabolism and the process of oxidative stress in the endoplasmic reticulum stress autophagy induced by cerebral ischemia and reperfusion plays an important role, but its mechanism is not very clear.
The Keap1-Nrf2-ARE signal transduction pathway is the primary defense mechanism for oxidative stress. Under the condition of autophagy related protein p62 as a multifunctional protein, not only can eliminate the damage of organelles, protein degradation, abnormal aggregation and interaction with various proteins in the cell area of p62 stress, play a role in cell survival and molecular cohesion many signal transduction pathways. Studies have shown that under oxidative stress conditions, a positive feedback loop between p62 and Nrf2, through the Keap1-Nrf2-ARE signaling pathway, promote antioxidant gene expression. Therefore, to explore the process of multifunctional protein p62 in cerebral ischemia reperfusion injury in the role may further clarify the regulatory mechanism between cells autophagy and oxidative stress.
The late autophagosome and lysosome fusion of autophagy is a typical vesicle fusion event.NSF, as a ATP enzyme, produced by using its ATP hydrolysis energy mediated vesicle fusion dissociation of SNARE complex after the release of SNARE into a vesicle fusion process, vesicle fusion is carried out smoothly a key protein required. In vitro studies showed that only in the cytoplasm of soluble NSF in the presence of ATP conditions can be mediated by fusion of vesicles, if the soluble NSF aggregation and ATP deletion will lose the function. Obviously, ATP fusion protein NSF function key are associated with vesicles by replication in vitro experimental cerebral ischemia reperfusion model, to observe the changes of energy metabolism during vesicle fusion protein NSF, and to explore the regulation of cerebral ischemic injury between energy metabolism and autophagy may. Mechanism.
Objective:
This study is based on the energy metabolism disorder / oxidative stress on cell damage caused by at the same time, may activate adaptive response to endoplasmic reticulum stress - autophagy, to investigate the role of endoplasmic reticulum stress and autophagy in cell energy metabolism and oxidative stress, and provides new clues for elucidating the mechanism of cerebral ischemia reperfusion injury.
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本文編號：1516858