發(fā)布時間：2018-02-11 15:24

  本文關(guān)鍵詞： 卡馬西平 丁苯酞 認(rèn)知 凋亡 海馬CA1區(qū) 海馬CA3區(qū) 浦肯野細(xì)胞 透射電鏡　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：目的:卡馬西平(Carbamazepine,CBZ)又稱酰胺咪嗪,與三環(huán)類抗抑郁藥結(jié)構(gòu)相似,通過阻斷電壓依賴性鈉離子通道,減少突觸前谷氨酸(Glu)釋放和細(xì)胞內(nèi)環(huán)磷酸腺苷(c AMP)水平,增加腦內(nèi)5-羥色胺(5-HT)水平,從而降低神經(jīng)元興奮性。CBZ作為一線抗癲癇藥物(antiepileptic drugs,AEDS),因其價格低廉,療效顯著,臨床應(yīng)用非常廣泛。但AEDS療程長、依從性差且個體間不良反應(yīng)差異大、副作用多,癥狀表現(xiàn)各異,可累及多個器官及系統(tǒng)。丁苯酞(dl-3-n-butylphthalide,NBP)在改善腦缺血、促進(jìn)腦缺血后神經(jīng)功能恢復(fù)方面有明顯效果,近期研究證明,NBP不僅從形態(tài)和功能上對線粒體發(fā)揮保護作用,還可以降低神經(jīng)細(xì)胞凋亡百分率,并能上調(diào)大鼠缺血腦組織中的BDNF的表達(dá),達(dá)到神經(jīng)保護作用。為排除癲癇發(fā)作本身對認(rèn)知功能及凋亡的損害,了解CBZ對認(rèn)知損傷的差異性,本實驗以形態(tài)學(xué)為基礎(chǔ),通過觀察CBZ及NBP對大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、小腦神經(jīng)細(xì)胞凋亡及認(rèn)知的影響,探討CBZ對神經(jīng)系統(tǒng)毒副作用以及NBP抑制凋亡、改善認(rèn)知的作用機制,為更好地指導(dǎo)臨床用藥、減少藥物不良反應(yīng)提供理論依據(jù)。方法:1實驗動物及分組:7周齡健康雄性成熟SD(Sprague-Dawley)大鼠(河北醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供)36只,實驗起始體重150~190g;自然晝夜,22~25℃環(huán)境喂養(yǎng),每籠6只,換氣扇通風(fēng),標(biāo)準(zhǔn)飼料喂養(yǎng),自由進(jìn)食和飲水。隨機分為YY組(NS+花生油),NBP組(NBP+花生油+NS組),C1組(CBZ低劑量+NS+花生油組),C2組(CBZ高劑量+NS+花生油),NC1組(CBZ低劑量+NS+NBP+花生油),NC2組(CBZ高劑量+NS+NBP+花生油),每組6只。按人與大鼠給藥劑量的換算公式(以公斤體重計算,大鼠的劑量為人用藥劑量的6.25倍),具體為低劑量CBZ 125mg/kg/d,NBP 80mg/kg/d,高劑量CBZ采取LD50的1/8,具體劑量為高劑量CBZ 500mg/kg/d,一天一次灌胃器灌胃30天。2灌注及取材:10%的水合氯醛麻醉后仰臥固定,剪開胸骨,暴露心臟,灌注針經(jīng)心尖部入左心室經(jīng)主動脈瓣入升主動脈,同時剪開右心耳放血,先快速注入生理鹽水,以止血鉗夾固灌注針,右心耳流出無色液體后,用4%的多聚甲醛固定,待灌注成功后立即斷頭取材,放入4%的多聚甲醛固定液中進(jìn)行固定24小時。標(biāo)本經(jīng)過脫水、透明、石蠟包埋及切片,供HE、尼氏染色、免疫組化測定使用。另外每組隨機選取2只大鼠麻醉后用1%多聚甲醛-1.25%戊二醛0.1M磷酸緩沖液灌流固定后,取大鼠海馬區(qū)域的腦組織標(biāo)本,經(jīng)透射電子顯微鏡觀察海馬組織CA1區(qū)神經(jīng)元及小腦浦肯野細(xì)胞結(jié)構(gòu)。3凋亡及認(rèn)知指標(biāo)測定:大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)及小腦皮質(zhì)浦肯野細(xì)胞蠟切片經(jīng)HE染色光鏡下觀察大鼠腦組織的形態(tài)學(xué)變化,尼氏染色觀察尼氏小體的變化,水迷宮觀察大鼠認(rèn)知行為學(xué)的變化,免疫組化染色法觀察凋亡相關(guān)基因Bax及Bcl-2的表達(dá)情況和認(rèn)知相關(guān)基因BDNF的表達(dá)情況。4統(tǒng)計學(xué)處理:應(yīng)用SPSS 13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。多組間均數(shù)顯著性檢驗應(yīng)用One-Way ANOVA,其中方差齊性資料采用SNK檢驗進(jìn)行兩兩組間比較;非齊性資料用Tamhane’S T2檢驗,當(dāng)P0.05時認(rèn)為差異具有顯著性。結(jié)果:1 HE染色結(jié)果1.1海馬CA1及CA3區(qū):各組腦組織結(jié)構(gòu)完整,細(xì)胞密集,排列整齊。偶見細(xì)胞皺縮,與周圍細(xì)胞分離,嗜酸性染色增強,細(xì)胞核、染色質(zhì)聚集成團塊狀,與YY組相比,無明顯形態(tài)學(xué)改變。1.2小腦浦肯野細(xì)胞:各組可見浦肯野細(xì)胞密集,排列整齊,偶見細(xì)胞體積縮小,與YY組相比,無明顯形態(tài)學(xué)差異。2尼氏染色結(jié)果2.1海馬CA1及CA3區(qū):各組海馬錐體細(xì)胞密度大且排列規(guī)則,細(xì)胞質(zhì)染色清晰,呈均勻一致的紫藍(lán)色,胞漿中可見尼式小體,神經(jīng)元未見異常形態(tài)改變。2.2小腦浦肯野細(xì)胞:Nissl染色能顯示浦肯野細(xì)胞胞體及與連接胞體的主樹突,胞質(zhì)中可見成斑塊狀堆積的藍(lán)紫色尼體小體,胞核及其核仁清晰可見,神經(jīng)元未見異常形態(tài)改變。3免疫組化染色法檢測Bax、Bcl-2及BDNF表達(dá)結(jié)果3.1 Bax表達(dá)結(jié)果3.1.1海馬CA1區(qū):CBZ組可見Bax表達(dá)陽性細(xì)胞明顯增多,胞漿呈棕黃色,染色較深。YY組和NBP組可見Bax表達(dá)陽性細(xì)胞稀疏、散在分布,且染色淺淡。通過采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定Bax表達(dá)陽性細(xì)胞的平均光密度值(OD值),C1組與C2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),該兩組的Bax表達(dá)比其余四組均增高,與其余四組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);NC1組與NC2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),該兩組與C1組與C2組相比的Bax表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與YY組與NBP組相比Bax表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.1.2海馬CA3區(qū):各組均可見少量、散在分布的Bax表達(dá)陽性細(xì)胞,測定Bax表達(dá)陽性細(xì)胞的OD值,C1組與C2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),該兩組的Bax表達(dá)比其余四組均增高,與其余四組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);NC1組與NC2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),該兩組與C1組及C2組相比的Bax表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與YY組及NBP組相比Bax表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.1.3小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):NC1組與NC2組相比Bax表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),該兩組與C1組及C2組相比Bax表達(dá)減少,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01),與YY組及NBP組相比Bax表達(dá)增高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);NBP組比YY組Bax表達(dá)減少,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01)。3.2 Bcl-2表達(dá)結(jié)果3.2.1海馬CA1區(qū):C1組和C2組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞顯著增多,胞質(zhì)呈棕黃色或褐色,染色較深。NBP組和YY組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞稀疏、散在分布,細(xì)胞著色淺淡。CBZ+NBP組Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞著色較CBZ組明顯稍淺。通過采用Image Pro Plus 6.0圖像分析系統(tǒng)測定Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞的平均光密度值(OD值),各組之間相比存在差異,但差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.2.2海馬CA3區(qū):各組均可見Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞廣泛分布,胞質(zhì)深染呈棕黃色或褐色,測定Bcl-2表達(dá)陽性細(xì)胞的OD值,各組之間Bcl-2表達(dá)存在差異但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.2.3小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):各組之間Bcl-2表達(dá)存在差異但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.3 BDNF表達(dá)結(jié)果3.3.1海馬CA1區(qū):在放大400倍的光學(xué)顯微鏡下觀察,BDNF免疫組織化學(xué)陽性細(xì)胞主要集中在海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)錐體細(xì)胞,表現(xiàn)為整個細(xì)胞胞漿著色呈棕黃色,各組均可見BDNF表達(dá),表達(dá)量較高,各組OD值相比,但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.3.2海馬CA3區(qū):各組均可見BDNF表達(dá),但差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。3.3.3小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):BDNF在海馬表達(dá)的最多,浦肯野細(xì)胞的BDNF表達(dá)明顯減少。對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析得出:各組間兩兩比較差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。4水迷宮結(jié)果4.1水迷宮逃避潛伏期結(jié)果:從訓(xùn)練的第2天開始,六組大鼠逃避潛伏期均有下降的趨勢,說明訓(xùn)練可以增強學(xué)習(xí)記憶能力,各組大鼠通過4天的訓(xùn)練,建立了空間記憶(p0.01),但各組大鼠間學(xué)習(xí)記憶能力無明顯不同(P0.05)。4.2水迷宮穿越平臺次數(shù)結(jié)果:各組之間穿越平臺次數(shù)的均數(shù)比較存在差異,但無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5透射電鏡觀察結(jié)果5.1海馬CA1區(qū):各組海馬CA1區(qū)細(xì)胞大體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常,細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元核膜清晰,核質(zhì)均勻,核膜無內(nèi)陷,胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富,胞質(zhì)內(nèi)可見大量的核糖體,線粒體無腫脹、線粒體嵴無斷裂,粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)池?zé)o擴張。5.2小腦浦肯野細(xì)胞區(qū):各組浦肯野細(xì)胞細(xì)胞大體結(jié)構(gòu)未發(fā)現(xiàn)異常。細(xì)胞內(nèi)神經(jīng)元核膜清晰,核質(zhì)均勻,核膜無內(nèi)陷,胞質(zhì)中細(xì)胞器豐富。結(jié)論:1灌服常規(guī)劑量卡馬西平,對正常成年SD大鼠海馬及小腦Bax、Bcl-2表達(dá)有影響,對神經(jīng)元形態(tài)結(jié)構(gòu)及認(rèn)知功能無明顯改變,說明卡馬西平短期服用對神經(jīng)元的損害可能是可逆的,且機體的自身調(diào)節(jié)使凋亡難度增加,可能是一種機體對藥物損害的保護性反應(yīng);2卡馬西平對正常大鼠認(rèn)知功能無明顯影響;3丁苯酞對正常大鼠認(rèn)知及凋亡無明顯影響,對海馬神經(jīng)元無損傷;4丁苯酞對卡馬西平造成的正常成年SD大鼠海馬CA1區(qū)、CA3區(qū)、小腦浦肯野細(xì)胞區(qū)Bax表達(dá)有降低作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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1 楊衛(wèi)紅;廖松潔;陳興泳;黃如訓(xùn);裴中;曾進(jìn)勝;;丁苯酞抗缺血性腦損害的靶細(xì)胞研究[J];中國臨床藥理學(xué)雜志;2012年11期

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本文編號：1503377