發(fā)布時(shí)間：2018-02-09 09:53

  本文關(guān)鍵詞： 膠質(zhì)瘤 血管生成擬態(tài) 膠質(zhì)纖維性蛋白 波形蛋白 預(yù)后　出處：《南方醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：一、研究背景 腦膠質(zhì)瘤是成年人中最常見的顱內(nèi)原發(fā)腫瘤,盡管臨床上具備手術(shù)聯(lián)合放化療等全面綜合治療手段,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者的中位生存期也僅為12-15月。其不容樂觀的臨床預(yù)后與膠質(zhì)瘤自身浸潤(rùn)性生長(zhǎng)的生物學(xué)特性有關(guān),而瘤組織中微血管異常增生、高度血管化畸形在腫瘤的侵襲性生長(zhǎng)過程中起重要作用。因此,腫瘤血管生成的相關(guān)研究一直成為熱點(diǎn)。當(dāng)前已在膠質(zhì)瘤中得到證實(shí)并較公認(rèn)的血管生成方式包括：血管共同選定(vascular co-option)、成血管細(xì)胞募集(vasculogenesis)和出芽式血管生成(angiogenesis)。隨著研究不斷深入,近年來又發(fā)現(xiàn)了一種與經(jīng)典內(nèi)皮依賴性腫瘤血管生成途徑完全不同的血液供應(yīng)方式—“血管生成擬態(tài)”(Vasculogenic mimicry, VM)。此概念于1999年由美國Iowas大學(xué)Maniotis和Folberg等根據(jù)對(duì)人眼葡萄膜黑色素瘤微循環(huán)的研究而提出,主要描述的是高度侵襲性腫瘤細(xì)胞通過自身可塑性和基質(zhì)重構(gòu)產(chǎn)生具有微循環(huán)功能的類血管樣通道,通道內(nèi)無血管內(nèi)皮細(xì)胞襯覆,卻能滿足瘤組織血液供應(yīng)。隨后,在多種非黑色素瘤惡性腫瘤組織中,如乳腺癌、滑膜肉瘤、橫紋肌肉瘤、前列腺癌、腦膠質(zhì)瘤等,都相繼報(bào)道了血管生成擬態(tài)。 2005年,Yue和Chen等人在45例星形細(xì)胞瘤患者中證實(shí)有2例標(biāo)本存在血管生成擬態(tài)現(xiàn)象。他們利用CD34/PAS雙重染色法對(duì)膠質(zhì)瘤標(biāo)本進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)某些標(biāo)本中存在PAS陽性CD34陰性的網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)相互連結(jié)形成半閉合或完全閉合的環(huán),中空的環(huán)狀結(jié)構(gòu)里面發(fā)現(xiàn)有紅細(xì)胞和血漿。這些現(xiàn)象與Folberg等人提出的圖案樣基質(zhì)型血管生成擬態(tài)描述完全一致。E1Hallani等在2010年使用CD34/PAS雙重染色法觀察膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中的微血管,也發(fā)現(xiàn)了一種與CD34+的內(nèi)皮細(xì)胞依賴性血管不同的管道型血管。這種管道可見紅細(xì)胞存在,但是其管道壁上襯覆的是CD34-的細(xì)胞。為了明確該管道的性質(zhì),研究者對(duì)病理組織標(biāo)本進(jìn)行連續(xù)切片的免疫組織化學(xué)染色觀察,發(fā)現(xiàn)CD34+細(xì)胞構(gòu)成的管道和CD34"細(xì)胞排列形成細(xì)胞的管道之間存在相連接的區(qū)域,并進(jìn)一步證實(shí)了這種管道樣血管實(shí)質(zhì)上是內(nèi)皮依賴性血管的延續(xù)。Shaifer等人提出膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(GBMs)中的VM存在與腫瘤的放療抵抗有關(guān)。他們?cè)谌S器官型培養(yǎng)基上共同培養(yǎng)GFP轉(zhuǎn)染的膠質(zhì)瘤細(xì)胞和紅色活性染料標(biāo)記的內(nèi)皮細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)首先是內(nèi)皮細(xì)胞形成血管結(jié)構(gòu),接著膠質(zhì)瘤細(xì)胞在48小時(shí)內(nèi)整合加入形成馬賽克血管網(wǎng)絡(luò)。在血管生成的條件下,膠質(zhì)瘤細(xì)胞形成三維立體的血管網(wǎng)絡(luò),但是這些膠質(zhì)瘤細(xì)胞始終未表達(dá)特異性內(nèi)皮細(xì)胞分子,表明該血管樣網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)就是血管生成擬態(tài)(VM)。Liu等人認(rèn)為血管生成擬態(tài)(VM)是影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的不良因素之一,同時(shí)有趣的發(fā)現(xiàn)瘤組織中的VM大多出現(xiàn)在微血管密度較低的區(qū)域,從而提出VM很可能是腫瘤新生血管的一種補(bǔ)充方式。該研究在探討VM陽性患者的不良預(yù)后是否由膠質(zhì)瘤WHO高級(jí)別所決定的時(shí)得出的結(jié)論卻是,膠質(zhì)母細(xì)胞瘤(WHOIV級(jí))中是否存在血管生成擬態(tài)對(duì)其預(yù)后沒有影響。但該研究樣本量偏小,需要進(jìn)一步研究來證實(shí)。 目前普遍認(rèn)為,腫瘤細(xì)胞的可塑性(tumor cell plasticity)是VM形成的關(guān)鍵環(huán)節(jié),其相關(guān)機(jī)制還尚未完全明確。腫瘤細(xì)胞模擬其他類型細(xì)胞的基因表達(dá)和生物學(xué)行為的特性被稱為“可塑性”,它是VM形成的分子基礎(chǔ)。腫瘤細(xì)胞的可塑性,與細(xì)胞生長(zhǎng)、粘附和形態(tài)的改變密切相關(guān)。細(xì)胞形態(tài)學(xué)上的改變往往能反映細(xì)胞的生長(zhǎng)特性與功能的改變。而細(xì)胞骨架(cytoskeleton)是決定細(xì)胞形態(tài)的主要物質(zhì)。正常情況下,細(xì)胞骨架與胞膜連接,與細(xì)胞外基質(zhì)進(jìn)行跨膜反應(yīng),控制膜受體及微絲粘著斑的活性狀態(tài),進(jìn)而調(diào)節(jié)細(xì)胞的黏附和運(yùn)動(dòng)；而骨架系統(tǒng)結(jié)構(gòu)的變化可干擾信號(hào)傳導(dǎo)系統(tǒng)的工作,最終導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞發(fā)生生物學(xué)性狀改變。因此考慮膠質(zhì)瘤細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)的重塑與血管生成擬態(tài)(VM)發(fā)生過程中腫瘤細(xì)胞可塑性的形成密切相關(guān)。然而,國內(nèi)外至今尚未見有關(guān)此方面報(bào)道。 二、研究目的及意義 本研究利用免疫組織化學(xué)和特殊組織化學(xué)結(jié)合的雙重染色技術(shù),觀察63例人腦膠質(zhì)瘤患者石蠟標(biāo)本中血管生成擬態(tài)(VM)在膠質(zhì)瘤組織中的生成特點(diǎn),分析VM與膠質(zhì)瘤患者的臨床病理因素、臨床預(yù)后轉(zhuǎn)歸的關(guān)系；并進(jìn)一步檢測(cè)膠質(zhì)瘤組織中GFAP、Vimentin和Ki-67的表達(dá),初步探討它們?cè)赩M形成中的作用。旨在尋找影響膠質(zhì)瘤患者預(yù)后的新指標(biāo),同時(shí)為抗腫瘤血管生成治療提供新的思路及可能的靶點(diǎn)。 三、實(shí)驗(yàn)過程 1材料和方法 1.1臨床資料收集存檔于南方醫(yī)科大學(xué)珠江醫(yī)院病理科2008年1月-2011年12月期間診斷為腦膠質(zhì)瘤的石蠟標(biāo)本63例。所選病例臨床病理資料完整,患者在術(shù)前均未接受過放療及化療。其中男40例,平均年齡55±25.5歲,女23例,平均年齡54±31歲。依據(jù)中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤WHO(2007)分級(jí)標(biāo)準(zhǔn),包括WHOⅡ級(jí)17例,WHOⅢ級(jí)22例,WHOⅣ級(jí)24例。腫瘤大小以腫瘤切除的最大直徑計(jì)算。以電話的方式對(duì)入選患者進(jìn)行隨訪,隨訪時(shí)間從手術(shù)當(dāng)天開始到死亡時(shí)間或2012年12月截止,中位隨訪時(shí)間為55周。術(shù)后生存時(shí)間為8-271周,中位生存期為67±12.19周。術(shù)后2周之內(nèi)死亡不納入生存分析中,因?yàn)槠渌劳隹赡苁鞘中g(shù)的并發(fā)癥所致,不是疾病的自然進(jìn)程。 1.2實(shí)驗(yàn)試劑及方法采用免疫組織化學(xué)染色SP法,一抗分別為GFAP(即用型,兔抗人,編號(hào)ZA-0529)、Vimentin單克隆抗體(即用型,兔抗人,編號(hào)ZA-0511)、Ki-67(即用型,鼠抗人,7B11,ZM--0165)、CD34(即用型,鼠抗人,QBEnd/10,ZM--0046), SP試劑盒、DAB顯色劑均購自北京中杉金橋生物公司。CD34/PAS雙重染色方法,首先遵循免疫組化SP法進(jìn)行GFAP、Vimentin、Ki-67和CD34染色,DAB顯色后,進(jìn)行PAS復(fù)染(高碘酸溶液及雪夫試劑購自于珠海貝索生物技術(shù)有限公司)。 2. CD34/PAS雙重染色結(jié)果判定 CD34以血管內(nèi)皮細(xì)胞胞質(zhì)或胞膜出現(xiàn)棕黃色顆粒者為陽性,PAS陽性為染成淺粉色、紫紅色或玫瑰紅色。參照Maniotis等的標(biāo)準(zhǔn),由CD34染色陽性的細(xì)胞及PAS陽性細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)構(gòu)成的管道圍成的管腔樣結(jié)構(gòu)提示為內(nèi)皮依賴性血管；PAS陽性基底膜樣物質(zhì)和CD34陰性表達(dá)的腫瘤細(xì)胞圍成的管道樣結(jié)構(gòu),其內(nèi)可以見到紅細(xì)胞和(或)血漿,管腔周圍未見出血、壞死、微血栓形成及炎性細(xì)胞浸潤(rùn),該類結(jié)構(gòu)判定為VM。 3.免疫組化結(jié)果判定 Ki-67以腫瘤細(xì)胞核內(nèi)出現(xiàn)清晰棕黃色作為判斷標(biāo)準(zhǔn)。在高倍鏡下的腫瘤區(qū)內(nèi)選取10個(gè)代表性視野(×200),計(jì)算陽性腫瘤細(xì)胞數(shù)占所有腫瘤細(xì)胞數(shù)的百分比成為Ki-67指數(shù)(Ki67labeling index, Ki67LI)。GFAP定位于細(xì)胞漿,Vimentin定位于細(xì)胞漿,采用二級(jí)計(jì)分法計(jì)數(shù)陽性細(xì)胞,在光學(xué)顯微鏡200倍視野下,隨機(jī)選擇5個(gè)視野,計(jì)數(shù)每個(gè)高倍視野中陽性細(xì)胞,按Shimizu等所采用的評(píng)分標(biāo)準(zhǔn),根據(jù)表達(dá)陽性細(xì)胞比例及表達(dá)著色強(qiáng)度進(jìn)行計(jì)分。陽性細(xì)胞百分比計(jì)分：0分為表達(dá)陰性,1分為陽性細(xì)胞數(shù)5%,2分為陽性細(xì)胞數(shù)5%-25%,3分為陽性細(xì)胞數(shù)26%～50%,4分為陽性細(xì)胞數(shù)50%。每張切片陽性細(xì)胞的著色強(qiáng)度按無著色為0分,淡黃色為1分,棕黃色為2分,棕褐色分3分。再根據(jù)兩項(xiàng)乘積作為判斷表達(dá)結(jié)果,0分為陰性(-),1-2分為弱陽性(±),3-5分為陽性(+),6-7分為中等陽性(++),大于7分為強(qiáng)陽性(+++)。依據(jù)最終結(jié)果將GFAP和Vimentin分為兩組：低表達(dá)組包括(-)、(±)、(+)和高表達(dá)組包括(++)、(+++)。 4.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 應(yīng)用SPSS19.0軟件包進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。頻數(shù)資料采用四格表資料的χ2檢驗(yàn)和兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn),Mann-Whitney U檢驗(yàn)方法比較差異。無進(jìn)展生存期(PFS)為患者手術(shù)當(dāng)天至首次發(fā)現(xiàn)疾病進(jìn)展的時(shí)間,總生存期(OS)則為手術(shù)當(dāng)天至死亡的時(shí)間,失訪患者將在生存分析中作為刪失數(shù)據(jù)處理。生存數(shù)據(jù)單因素分析用Kaplan-Meier法,并用Log-rank法進(jìn)行差異顯著性比較。應(yīng)用Cox比例風(fēng)險(xiǎn)模型,研究多種因素對(duì)生存時(shí)間的影響。P0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 四、研究結(jié)果 1、血管生成擬態(tài)(VM)存在于腦膠質(zhì)瘤組織中：63例膠質(zhì)瘤患者石蠟切片經(jīng)CD34/PAS雙重染色,顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)13例(13/63,20.6%)存在VM。鏡下可觀察到VM由CD34染色陰性的腫瘤細(xì)胞圍成管道樣結(jié)構(gòu),被一層PAS染色陽性的基質(zhì)完整環(huán)繞,管腔內(nèi)可見數(shù)量不一的紅細(xì)胞,無紅細(xì)胞滲出及血液凝固現(xiàn)象。襯覆于VM管壁的細(xì)胞呈多角形,胞核大而深染,核質(zhì)比例增大證實(shí)為瘤細(xì)胞。在同一個(gè)視野中可見管腔內(nèi)CD34染色陽性的內(nèi)皮依賴性血管和具有紅細(xì)胞的CD34陰性的VM。 2、VM的存在與腫瘤組織的惡性程度及復(fù)發(fā)情況關(guān)系密切：VM在高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤組織中發(fā)生率(WHOⅢ,4/15,19%; WHOIV,8/24,33.3%)顯著高于低級(jí)別患者(WHO Ⅱ,1/17,6.7%),其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.025)；VM陽性組患者的復(fù)發(fā)率(12/42,28.6%)顯著高于VM陰性者(1/21,4%),兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.008)。VM的存在與患者其他臨床病理參數(shù)如年齡、腫瘤大小、手術(shù)全切程度之間并無明顯相關(guān)性。 3、腦膠質(zhì)瘤組織中VM的存在與GFAP、Vimentin表達(dá)的關(guān)系：VM與在腦膠質(zhì)瘤組織中GFAP的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)(r=-0.478,P0.05),而與在腦膠質(zhì)瘤組織中Vimentin的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.336,P0.01)。存在VM的膠質(zhì)瘤組織中腫瘤細(xì)胞低表達(dá)GFAP,而高表達(dá)Vimentin(P0.05)。 4、腦膠質(zhì)瘤組織中VM與Ki-67的表達(dá)的關(guān)系：在VM陽性組和VM陰性組病例中,Ki-67LI分別為24.73%±11.64%和9.95%±10.98%,兩獨(dú)立樣本非參數(shù)檢驗(yàn)兩組差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(Z=-4.74,P=0.000)(表2)。Spearman相關(guān)分析顯示,VM與在腦膠質(zhì)瘤組織中Ki-67的表達(dá)呈正相關(guān)(r=0.531,P0.01)。 5、VM與腦膠質(zhì)瘤患者預(yù)后之間的關(guān)系：63例患者中有VM發(fā)生者13例,Kaplan-Meier法統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示存在VM的患者術(shù)后無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)和術(shù)后總生存時(shí)間(OS)均比VM陰性患者術(shù)后無進(jìn)展生存時(shí)間(PFS)和術(shù)后總生存時(shí)間(OS)顯著縮短,Log-rank檢驗(yàn)法比較生存曲線的差別,兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05) 6、COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型多因素分析結(jié)果：腫瘤組織病理分級(jí)、VM的存在、GFAP的表達(dá)、Vimentin的表達(dá)和年齡是影響膠質(zhì)瘤患者無進(jìn)展生存的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05)；而腫瘤組織病理分級(jí)、VM的存在和Vimentin的表達(dá)是影響膠質(zhì)瘤患者術(shù)后總生存時(shí)間的獨(dú)立危險(xiǎn)因素(P0.05)。 五、研究結(jié)論 1、膠質(zhì)瘤組織中存在血管生成擬態(tài)(VM),并且VM與腫瘤組織的發(fā)生、發(fā)展及侵襲、復(fù)發(fā)密切相關(guān)； 2、膠質(zhì)瘤組織中細(xì)胞骨架結(jié)構(gòu)蛋白的改變(重塑)——GFAP低表達(dá)和Vimentin高表達(dá)可能協(xié)同促進(jìn)血管生成擬態(tài)發(fā)生過程中腫瘤細(xì)胞可塑性的形成； 3、膠質(zhì)瘤中存在血管生成擬態(tài)(VM)的患者預(yù)后較差,VM是影響膠質(zhì)瘤患者不良預(yù)后的獨(dú)立因素； 4、聯(lián)合檢測(cè)膠質(zhì)瘤中VM、Ki-67、GFAP及Vimentin的情況,將有助于進(jìn)一步評(píng)估腫瘤組織的惡性程度及復(fù)發(fā)危險(xiǎn)性,并可作為判斷患者臨床預(yù)后的重要指標(biāo)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R739.41

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：1497657