本文關(guān)鍵詞： survivin CHAF1A 腺病毒 腦膠質(zhì)細(xì)胞瘤 凋亡　出處：《山東大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景：腦膠質(zhì)瘤是常見(jiàn)的顱內(nèi)腫瘤之一,對(duì)人體健康有巨大的危害。腦膠質(zhì)瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多步驟、多因素參與的過(guò)程,除了原癌基因的激活,抑癌基因的失活外,某些凋亡調(diào)控基因的異常表達(dá)在其中也起著重要作用,因此研究凋亡調(diào)控基因在腦膠質(zhì)瘤中的作用,明確其作用機(jī)理,將為腦膠質(zhì)瘤的診療提供重要的理論依據(jù)。Survivin是新近發(fā)現(xiàn)的凋亡抑制基因,它在多數(shù)腫瘤及胚胎組織中表達(dá)量較高,而在大多數(shù)正常組織中survivin均不表達(dá),其表達(dá)產(chǎn)物具有獨(dú)特的結(jié)構(gòu),并能夠通過(guò)一系列途徑抑制細(xì)胞凋亡或加速細(xì)胞分裂從而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖,因而對(duì)腫瘤細(xì)胞的存活起著重要的保護(hù)作用。由于在腫瘤組織中survivin過(guò)量表達(dá)的高度特異性,以及它在惡性腫瘤細(xì)胞生存中的作用,因而它很可能是將抗細(xì)胞凋亡和細(xì)胞惡變直接聯(lián)系起來(lái)的橋梁,因此survivin被認(rèn)為是抗腫瘤治療的一個(gè)重要靶點(diǎn)。另外,近年來(lái)隨著RNA干擾技術(shù)的不斷應(yīng)用與成熟,其高特異性與有效性已經(jīng)使它成為研究基因功能的一項(xiàng)非常重要的手段。那么,作為凋亡抑制蛋白,通過(guò)RNA干擾技術(shù)靶向抑制survivin的作用,能否抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng),其機(jī)制又是什么?染色質(zhì)組裝因子1亞基A (Chromatinassembly factor 1 subunit A, CHAF1A),是組蛋白伴侶的成員之一。研究表明,CHAF1A在細(xì)胞增殖、DNA修復(fù)以及胚胎干細(xì)胞的后天調(diào)節(jié)中起著重要作用。腫瘤細(xì)胞的特點(diǎn)是細(xì)胞過(guò)度增殖以及原癌基因/腫瘤抑制子功能失調(diào)導(dǎo)致的DNA修復(fù)功能紊亂。已有研究報(bào)道,過(guò)度表達(dá)CHAF1A與乳腺癌細(xì)胞的形成發(fā)展密切相關(guān)。因此,CHAF1A被認(rèn)為可能是多種腫瘤發(fā)病的驅(qū)動(dòng)基因之一。然而目前CHAF1A在膠質(zhì)瘤中的作用仍不清楚。為了解決以上問(wèn)題,本課題首先應(yīng)用RNA干擾技術(shù),構(gòu)建針對(duì)survivin基因的干擾shRNA,將其重組入腺病毒(survivin shRNA adenovirus vectors, Ad-survivin-sh RNA),并擴(kuò)增純化,分別在體內(nèi)及體外研究阻斷survivin表達(dá)對(duì)于膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響。首先,培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251細(xì)胞,加入重組腺病毒進(jìn)行轉(zhuǎn)染,應(yīng)用Hoechst33342染色及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)U251細(xì)胞凋亡；同時(shí)應(yīng)用CCK-8法檢測(cè)對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響；PCR及Western Blot分別檢測(cè)survivin基因及蛋白表達(dá)情況。進(jìn)而建立裸鼠U251膠質(zhì)瘤皮下模型,將重組腺病毒注入裸鼠腦膠質(zhì)瘤處進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染,觀察腫瘤生長(zhǎng)曲線,免疫組化檢測(cè)survivin蛋白表達(dá),TUN EL方法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。體內(nèi)及體外結(jié)果顯示,Ad-survivin-shRNA能夠降低survivin基因及蛋白的表達(dá),同時(shí)能夠增加細(xì)胞凋亡,抑制細(xì)胞增殖及腫瘤生長(zhǎng)。為了明確CHAF1A在膠質(zhì)瘤中的作用,本課題選用122例人腦膠質(zhì)瘤樣本,用免疫組化的方法檢測(cè)膠質(zhì)瘤中CHAF1A表達(dá)水平；應(yīng)用CRISPR/CAS9基因技術(shù),以慢病毒為載體敲除膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的CHAF1A,檢測(cè)對(duì)于細(xì)胞周期及凋亡的影響;同時(shí)檢測(cè)了與CHAF1A的生物學(xué)功能有關(guān)的信號(hào)通路的變化。我們的研究表明,CHAF1A的表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤病人的預(yù)后有關(guān),阻斷CHAF1A的表達(dá)能夠促進(jìn)細(xì)胞凋亡,抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。通過(guò)本項(xiàng)研究,能夠明確阻斷survivin及CHAF1A的表達(dá),對(duì)腦膠質(zhì)瘤U251、U87細(xì)胞的侵襲力、細(xì)胞活性、凋亡等生物學(xué)行為的影響,為今后深入研究并應(yīng)用于臨床提供了理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù),為腦膠質(zhì)瘤的治療提出了新方法、新思路。目的：探討survivin及CHAF1A對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用。方法：1.細(xì)胞培養(yǎng)人腦膠質(zhì)瘤U251或U87細(xì)胞培養(yǎng)于含10%胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液中,于37℃、5%C02培養(yǎng)箱培養(yǎng),隔日消化傳代,期間觀察細(xì)胞狀態(tài)。于感染前一天收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞,在計(jì)數(shù)板上計(jì)數(shù)并調(diào)濃度為105個(gè)/ml,接種于培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng),待細(xì)胞達(dá)到70%-80%融合時(shí)進(jìn)行病毒轉(zhuǎn)染。2.病毒制備Survivin腺病毒是由吉?jiǎng)P公司設(shè)計(jì)制作。其合成序列參考已發(fā)表文獻(xiàn)文獻(xiàn),具體序列為：sense,5'-GGACCACCGCATCTCTACA-3'; antisense, 5'-TGTAGAGATGCGGTGGTCC-3'。U251細(xì)胞按照濃度105 cells/ml培養(yǎng)過(guò)夜,然后根據(jù)合適的MOI值將Ad-su rvivin-sh RNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入U(xiǎn)251細(xì)胞。慢病毒購(gòu)自上海吉?jiǎng)P公司。將攜帶有基因敲除CHAF1A的慢病毒轉(zhuǎn)染進(jìn)入培養(yǎng)的U251細(xì)胞或者U87細(xì)胞。所用序列分別為：sg-EGFP:51-GGTGAACCGCATCGAGCTGA-3';sg-CHAF1A:5'-CCGACCTGTGGCGG CTCCCC-3'。3.病毒轉(zhuǎn)染先將U251細(xì)胞培養(yǎng)液棄掉,以無(wú)血清DMEM液稀釋腺病毒載體并加入96孔板中,置于孵箱,4h后換液,換為含10%滅活胎牛血清的DMEM完全培養(yǎng)液,繼續(xù)培養(yǎng)24h后在倒置熒光顯微鏡下觀察重組腺病毒載體攜帶的綠色熒光蛋白(GFP)的表達(dá),人工計(jì)數(shù)檢測(cè)Ad-survivin-shRNA腺病毒的轉(zhuǎn)染效率,即綠色蛋白的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù),確定最適感染復(fù)數(shù)MOI值。并在轉(zhuǎn)染24h、48h、72h、96h使用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)。Ad-survivin-shRNA腺病毒按照MOI值分別為50,100,200,500,1000pfu/cell設(shè)組稀釋病毒感染U251細(xì)胞；并設(shè)立陰性對(duì)照(不含干擾基因的腺病毒)及空白對(duì)照組。慢病毒轉(zhuǎn)染：在U251、U87細(xì)胞培養(yǎng)液中加入Lenti-CAS9慢病毒,轉(zhuǎn)染12h后更換培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng),3天后再加入sgRNA慢病毒,12h后換培養(yǎng)液,收集細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)研究。陰性對(duì)照組加入空慢病毒。U251細(xì)胞MOI=1,U87細(xì)胞MOI=5。4. Real-time PCR收集細(xì)胞,提取RNA并測(cè)濃度,同時(shí)用凝膠電泳及分光光度計(jì)的OD260/280比值判斷RNA質(zhì)量,將質(zhì)量合格的RNA做反轉(zhuǎn)錄,最后做實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)內(nèi)參actin及目的基因,并統(tǒng)計(jì)兩者灰度值比值。5. Western blot收集細(xì)胞,將細(xì)胞重懸于RIPA裂解液中,冰上裂解30min后離心,上清液為蛋白提取液,蛋白定量后加入1×SDS上樣緩沖液,反復(fù)吹打后98℃水浴5 min。冷卻后進(jìn)行SDS-PAGE分析,電泳結(jié)束后將蛋白轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素膜,用5%脫脂奶粉的TBS-T室溫封閉1h,加入一抗,4℃放置過(guò)夜。次日加入二抗,室溫孵育1 h。用增敏化學(xué)發(fā)光底物試劑(ECL)檢測(cè)。6. Hoechst33342染色取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期U251細(xì)胞懸液,加入24孔培養(yǎng)板使其終濃度為(2×105個(gè)/mL),培養(yǎng)過(guò)夜后加入重組腺病毒載體Ad-survivin-shRNA或空載體(陰性對(duì)照組),空白組不給予任何處理。37℃、5%CO2、飽和濕度條件下孵育4h后換液,于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)96h,4%多聚甲醛固定10min,加入Hoechst33342染液500ul,避光孵育5min,然后于倒置熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞核以判斷細(xì)胞的凋亡狀態(tài)(×100倍)。7.CCK-8測(cè)細(xì)胞增殖將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的U251按每孔100ul接種96孔板,置于細(xì)胞培養(yǎng)箱過(guò)夜培養(yǎng)。次日,將Ad-survivin-shRNA腺病毒載體及陰性對(duì)照病毒加入U(xiǎn)251細(xì)胞,每組設(shè)三個(gè)復(fù)孔,以DMEM完全培養(yǎng)液做空白對(duì)照,再置于37。C、5%C02飽和濕度的條件下培養(yǎng)。分別于培養(yǎng)24、48、72、96 h時(shí)取出一塊96孔板,每孔加入10 μl的CCK-8液,于37℃條件下孵育2h后,用酶標(biāo)儀測(cè)定各孔在450 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)的吸光度(A)值。根據(jù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果數(shù)據(jù)計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率,并繪制細(xì)胞增殖抑制曲線,分析藥物作用的效果。細(xì)胞增殖抑制率(%)=(對(duì)照組A值一實(shí)驗(yàn)組A值)/對(duì)照組A值x100%。8.流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞懸液,培養(yǎng)過(guò)夜后加入病毒載、陰性對(duì)照組病毒空載體,37℃、5%CO2、飽和濕度條件下共同孵育4h后換液,于37℃、5%CO2、飽和濕度條件下繼續(xù)培養(yǎng)。48 h、72 h、96h后取出24孔板,吸盡培養(yǎng)液,置搖床上以PBS洗三次,每次5min,吸盡PBS然后各管加入195μlAnnexinV-PE結(jié)合液,再加入5μlAnnexin V-PE,輕輕混勻。室溫避光孵育20分鐘。300目濾網(wǎng)過(guò)濾細(xì)胞,上流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-PE陽(yáng)性率。9.腫瘤細(xì)胞接種裸鼠六周大裸鼠在右前臂區(qū)域皮下注射U251細(xì)胞,每天測(cè)量腫瘤大小直至其直徑達(dá)到5mm。將以上動(dòng)物分為三組,分別在腫瘤組織中注射以下三種試劑：注射生理鹽水組,注射Ad-survivin-shRNA組,注射空病毒載體組。每三天在腫瘤組織中注射一次,每?jī)商鞙y(cè)量一次腫瘤體積。腫瘤體積=腫瘤最長(zhǎng)直徑×寬度2(與最長(zhǎng)直徑垂直的最長(zhǎng)直徑)×0.5。10.免疫組化取材后及時(shí)固定,常規(guī)酒精脫水、用二甲苯透明、進(jìn)蠟后石蠟包埋然后切片,厚度為4μm；經(jīng)烤片,常規(guī)脫蠟,梯度酒精脫水后,于3%H2O2中浸泡15min,去除內(nèi)源性的過(guò)氧化物酶；經(jīng)過(guò)修復(fù)抗原后,于玻片上滴加正常羊血清工作液,室溫封閉20min；滴加一抗,放入4℃冰箱,孵育過(guò)夜；滴加二抗,二抗是用辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記,室溫孵育1小時(shí)；DAB顯色劑顯色,流水充分沖洗；最后蘇木素復(fù)染3 min,水洗；常規(guī)脫水,透明,干燥,中性樹膠封片。11.TUNEL染色玻片室溫下干燥,二甲苯浸洗2次,每次5min；用梯度乙醇(100、95、90、80、70%)各浸洗1次,每次3min；用Proteinase K工作液處理組織15-30 min; PBS漂洗2次；每張切片滴加TdT酶混合反應(yīng)液100μl,37℃反應(yīng)60min(陰性對(duì)照不加TdT酶)；PBS漂洗3次；玻片干后加50μl converter-POD,37℃暗濕盒中反應(yīng)30min；在組織處加100μlDAB底物,室溫孵育10min；最后用蘇木素復(fù)染；梯度酒精脫水、二甲苯透明、中性樹膠封片。12.MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖細(xì)胞轉(zhuǎn)染CHAF1AsgRNA慢病毒或空病毒載體后孵育過(guò)夜,按照濃度為105/孔接種于六孔板,于每孔加MTT液50ug,放回孵育箱內(nèi)孵育4小時(shí),連續(xù)孵育5天,每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔,每次實(shí)驗(yàn)重復(fù)三次,最后用分光光度計(jì)分別檢測(cè)OD值。13.集落形成實(shí)驗(yàn)病毒感染細(xì)胞后培養(yǎng)過(guò)夜,按照濃度5X102/孔培養(yǎng)兩周后,用PBS清洗,固定,最后用0.5%結(jié)晶紫染色。顯微鏡下觀察集落數(shù)量。14.細(xì)胞周期檢測(cè)細(xì)胞轉(zhuǎn)染后,用胰蛋白酶消化后,用70%酒精固定,棄掉酒精,用PBS清洗三遍,重懸細(xì)胞,37℃孵育30min,最后放入FACSCalibur儀器,數(shù)據(jù)用CellQuest Pro軟件進(jìn)行分析。結(jié)果：1.腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用1.1 MOI值得確定在倒置熒光顯微鏡下觀察GFP表達(dá),確定轉(zhuǎn)染率。MOI值為1000pfu/cell時(shí),腺病毒的轉(zhuǎn)染效率可達(dá)到95%以上,轉(zhuǎn)染24小時(shí)細(xì)胞形態(tài)無(wú)明顯變化,說(shuō)明此劑量的腺病毒對(duì)細(xì)胞無(wú)明顯直接損傷作用,48h后熒光強(qiáng)度進(jìn)一步增強(qiáng),因此最終確定Ad-survivin-shRNA腺病毒載體MOI=1000作為最適感染復(fù)數(shù)進(jìn)行后續(xù)的實(shí)驗(yàn)。1.2腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin對(duì)U251細(xì)胞形態(tài)的影響Ad-survivin-shRNA腺病毒感染U251細(xì)胞48h后細(xì)胞數(shù)目較空白對(duì)照組及陰性病毒對(duì)照組有明顯的減少,且細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變,細(xì)胞間突觸回縮,變少,細(xì)胞變圓懸浮,部分細(xì)胞出現(xiàn)空泡,隨時(shí)間延長(zhǎng),形態(tài)變化更明顯。陰性病毒對(duì)照組未見(jiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。1.3腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin對(duì)U251細(xì)胞中survivin mRNA及蛋白表達(dá)的影響Real-time PCR結(jié)果發(fā)現(xiàn),與陰性對(duì)照組U251細(xì)胞相比,survivin mRNA表達(dá)水平隨Ad-survivin-shRNA作用時(shí)間延長(zhǎng)有逐漸降低的趨勢(shì),陰性病毒對(duì)照組survivin mRNA表達(dá)水平無(wú)明顯變化(P0.05),說(shuō)明Ad-survivin-shRNA阻斷了U251中survivin mRNA的表達(dá)。Western blot的結(jié)果發(fā)現(xiàn),與Real-time PCR結(jié)果一致,與對(duì)照組相比,隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間的延長(zhǎng),survivin蛋白表達(dá)逐漸降低,進(jìn)一步說(shuō)明Ad-survivin-shRNA能夠抑制體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251中survivin的表達(dá)。1.4腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響為了觀察Ad-survivin-shRNA對(duì)于U251細(xì)胞增殖的影響,我們應(yīng)用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果發(fā)現(xiàn),Ad-survivin-shRNA干擾U251細(xì)胞,細(xì)胞增殖明顯受抑制。1.5腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin對(duì)U251細(xì)胞凋亡的影響Hoechst33342染色結(jié)果顯示,陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組細(xì)胞核基本呈橢圓形或接近圓形,大小均一,淡藍(lán)色；Ad-survivin-shRNA組可見(jiàn)細(xì)胞核固縮,凝集,染色高亮,說(shuō)明經(jīng)Ad-survivin-shRNA腺病毒干擾后U251細(xì)胞發(fā)生凋亡。接下來(lái)的流式結(jié)果顯示,空白對(duì)照組U251細(xì)胞Annexin V-PE陽(yáng)性率為0.8%±0.12,陰性對(duì)照組U251細(xì)胞Annexin V-PE陽(yáng)性率為2.9%±0.1,Ad-survivin-shRNA組48h、72h及96h細(xì)胞AnnexinV-PE陽(yáng)性率分別為9.4%±0.14、14.0%±0.12、28.9%±0.15,表明survivin被干擾之后,U251細(xì)胞發(fā)生凋亡現(xiàn)象。1.6腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin影響腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)為了在研究腺病毒阻斷Survivin在體內(nèi)對(duì)腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞的影響,我們選擇在裸鼠右前臂區(qū)域分別注射生理鹽水、Ad-survivin-shRNA及空病毒載體。結(jié)果發(fā)現(xiàn),注射Ad-survivin-shRNA組與空白對(duì)照組及陰性對(duì)照組相比,從第9天開始,腦膠質(zhì)瘤體積增長(zhǎng)明顯減慢,說(shuō)明阻斷survivin能夠抑制腦膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng)。1.7腺病毒介導(dǎo)阻斷Survivin對(duì)腦膠質(zhì)瘤組織中survivin蛋白及細(xì)胞凋亡的影響為了觀察Ad-survivin-shRNA對(duì)于腦膠質(zhì)瘤組織中survivin蛋白的影響,在最后一次注射完畢后三天取出腫瘤組織,首先用免疫組織化學(xué)染色的方法檢測(cè)survivin蛋白的變化。結(jié)果顯示,與陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組相比,survivin干擾組中survivin的蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05)。進(jìn)一步TUNEL染色結(jié)果顯示,空白對(duì)照組瘤組織中TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞極少見(jiàn)；Negative組瘤組織中TUNNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)與空白對(duì)照組差別不大;Ad-survivin-shRNA組TUNEL染色陽(yáng)性細(xì)胞百分率明顯增多,細(xì)胞凋亡指數(shù)增加,提示有大量凋亡發(fā)生。2. CHAF1A;對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用2.1CHAF1A表達(dá)水平與膠質(zhì)瘤預(yù)后有關(guān)本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用122例膠質(zhì)瘤患者外科手術(shù)切除的膠質(zhì)瘤樣本進(jìn)行研究。我們首先用免疫組化方法,檢測(cè)了122例樣本中CHAF1A表達(dá)水平,結(jié)果顯示CHAF1A蛋白表達(dá)越高,膠質(zhì)瘤惡性程度越高,腫瘤體積越大。CHAF1A蛋白表達(dá)量與病人年齡及性別無(wú)關(guān)。另外,基因分析研究發(fā)現(xiàn),低表達(dá)CHAF1A的病人較高表達(dá)CHAF1A病人生存期長(zhǎng)。2.2用CRISPR/CAS9敲除CHAF1A能夠抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖我們應(yīng)用CRISPR/CAS9敲除CHAF1A,選用MTT及集落形成的方法觀察對(duì)于U251細(xì)胞及U87細(xì)胞增殖情況。我們的結(jié)果發(fā)現(xiàn),敲除CHAF1A能夠顯著抑制細(xì)胞增殖,同時(shí)CHAF1A基因敲除后導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞集落數(shù)量減少,說(shuō)明CHAF1A能夠調(diào)控膠質(zhì)瘤細(xì)胞的增殖。2.3用CRISPR/CAS9敲除CHAF1A能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期及凋亡為了進(jìn)一步探討敲除CHAF1A后抑制細(xì)胞增殖的機(jī)制,我們檢測(cè)了細(xì)胞周期。我們的結(jié)果顯示,抑制CHAF1A能夠誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞向G1期分化。為了檢測(cè)抑制CHAF1A對(duì)于細(xì)胞凋亡的影響,我們應(yīng)用Annexine-V反應(yīng)體系,發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染CHAF1A基因敲除的慢病毒組,細(xì)胞凋亡數(shù)量顯著增加。同時(shí)裂解的caspase-3和PARP顯著增加。說(shuō)明CHAF1A可能通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞周期及細(xì)胞凋亡影響膠質(zhì)瘤細(xì)胞的生存。2.4敲除CHAF1A能夠改變膠質(zhì)瘤細(xì)胞中FOXO3a的活性為了明確參與敲除CHAF1A后抑制細(xì)胞增殖的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路,我們用western blot的方法發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染基因敲除的CHAF1A組中Bcl-2, Mcl-1以及Bax沒(méi)有明顯變化,但Bim表達(dá)水平顯著增高。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn),轉(zhuǎn)染基因敲除CHAF1A慢病毒的U251及U87細(xì)胞中,FOXO3a (Ser253)磷酸化水平降低,但總FOXO3a并無(wú)變化,同時(shí)磷酸化Akt水平降低,說(shuō)明Akt可能介導(dǎo)了磷酸化FOXO3a對(duì)于CHAF1A的調(diào)節(jié)作用。結(jié)論：1.腺病毒介導(dǎo)阻斷survivin能夠抑制體外培養(yǎng)的腦膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞的增殖；同時(shí)促進(jìn)U251細(xì)胞凋亡；2.腺病毒介導(dǎo)阻斷survivin能夠抑制裸鼠體內(nèi)膠質(zhì)瘤的生長(zhǎng),降低膠質(zhì)瘤組織中survivin的表達(dá),促進(jìn)膠質(zhì)瘤組織細(xì)胞凋亡。3.過(guò)表達(dá)CHAF1A能夠通過(guò)Akt/FOXO3a/Bim通路促進(jìn)膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖,抑制凋亡。意義：本課題的研究將使我們進(jìn)一步明確survivin及CHAF1A在腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的作用；并為將來(lái)以survivin或者CHAF1A為目標(biāo)的腦膠質(zhì)瘤的治療提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

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