本文關(guān)鍵詞： 帕金森病 神經(jīng)保護(hù) deoxygedunin MPTP 帕金森病 天冬酰胺內(nèi)切酶 a-synuclein tau N368 帕金森病 AEP 魚藤酮 tau N368　出處：《華中科技大學(xué)》2016年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：第一部分TrkB受體激動(dòng)劑deoxygedunin對(duì)MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型的保護(hù)作用及機(jī)制研究目的研究小分子酪氨酸受體激酶B (tyrosine receptor kinase B, TrkB)激動(dòng)劑deoxygedunin對(duì)MPTP誘導(dǎo)PD小鼠模型的神經(jīng)保護(hù)作用。方法給予C57/BL6小鼠1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四羥吡啶(MPTP)腹腔注射(每次20mg/kg,2次/天,每次注射間隔2h)建立PD小鼠亞急性損傷模型。將36只8至9周大小的雄性C57/BL6小鼠隨機(jī)分為三組：正常組、PD組、deoxygedunin干預(yù)組(自造模開始deoxygedunin干預(yù)2周,5mg/kg/d, i.p.)。采用爬桿實(shí)驗(yàn)評(píng)估MPTP小鼠的運(yùn)動(dòng)功能：酪氨酸羥化酶免疫組化評(píng)估deoxygedunin對(duì)MPTP小鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體神經(jīng)纖維完整性的保護(hù)作用；免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)p-TrkB(Y816)與TH陽(yáng)性神經(jīng)元的共表達(dá)情況;RT-PCR檢測(cè)中腦黑質(zhì)BDNF、a-synuclein及TrkB mRNA表達(dá)水平；Western blot法檢測(cè)MPTP小鼠中腦黑質(zhì)TH、BDNF、 p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt(S473)/Akt、caspase-3、Bcl-xl的表達(dá)變化。結(jié)果MPTP給藥后模型組C57/BL6小鼠體重隨給藥時(shí)間逐漸下降,deoxygedunin能夠緩解MPTP引起的小鼠體重下降。在MPTP小鼠爬桿實(shí)驗(yàn)中,干預(yù)組小鼠頭轉(zhuǎn)向下時(shí)間(T-turn)及下至桿底時(shí)間(TLA)均較PD組小鼠明顯縮短(P0.05)。TH免疫組化發(fā)現(xiàn)經(jīng)干預(yù)組小鼠黑質(zhì)紋狀體酪氨酸羥化酶表達(dá)水平較PD模型組顯著升高(P0.05),同時(shí)中腦黑質(zhì)磷酸化TrkB的水平較PD模型組和正常對(duì)照組顯著升高(P0.05)。干預(yù)組和PD模型組小鼠黑質(zhì)BDNF mRNA表達(dá)較正常組升高,PD組a-synuclein mRNA表達(dá)較正常組和干預(yù)組升高,差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); deoxygedunin干預(yù)組TrkB mRNA表達(dá)水平較PD模型組和對(duì)照組顯著升高(P0.001)。在MPTP神經(jīng)毒性小鼠PD模型中,deoxygedunin干預(yù)組TH、 p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt (S473)/Akt、Bcl-xl蛋白表達(dá)均較PD模型組升高,caspase-3表達(dá)較對(duì)照組降低(P0.05)。結(jié)論deoxygedunin能夠改善MPTP神經(jīng)毒性小鼠模型的運(yùn)動(dòng)減少,可能通過激活TrkB受體及下游信號(hào)通路如PI3k/Akt及MAPK等,抑制凋亡信號(hào)通路,發(fā)揮多巴胺神經(jīng)元神經(jīng)保護(hù)作用。第二部分AEP特異性切割產(chǎn)物tau蛋白N368片段和a-synuclein在三種PD動(dòng)物模型中的表達(dá)目的天冬酰胺內(nèi)切酶(asparagine endopeptidase, AEP)激活并特異性切割tauN368片段是AD病理改變中發(fā)現(xiàn)的新現(xiàn)象,黑質(zhì)紋狀體a-synuclein的磷酸化和異常聚集是帕金森病(Parkinson's disease,PD)的主要病理改變,本研究擬在3種經(jīng)典PD模型中檢測(cè)AEP特異性切割的tau N 368片段和a-synuclein蛋白在黑質(zhì)、紋狀體、海馬等不同腦區(qū)是否存在共表達(dá)。方法帕金森動(dòng)物模型制備：(1)慢性MPTP PD小鼠模型：將20只8周齡C57 BL/6雄性小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,給予模型組小鼠背部皮下注射MPTP(25mg/kg/次),每周2次,連續(xù)5周；對(duì)照組經(jīng)同樣注射方式給予同等體積的生理鹽水。(2)慢性小鼠魚藤酮PD模型：將20只C57BL/6雄性小鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組,給予模型組小鼠背部皮下注射rotenone(1 mg/kg/d),連續(xù)注射50天;對(duì)照組按同樣方式給予同等體積的DMSO和生理鹽水混合液。(3)魚藤酮大鼠PD模型：將24只雌性SD大鼠,隨機(jī)分為對(duì)照組和模型組；給予模型組大鼠背部皮下注射rotenone (1.5mg/kg/day),連續(xù)注射5周：對(duì)照組按同樣方式給予同等體積的溶媒(DMSO和玉米油混合液)背部皮下注射。酪氨酸羥化酶免疫組化和熒光法評(píng)估不同PD模型黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的損傷情況;免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)三種PD模型海馬、皮質(zhì)、紋狀體和黑質(zhì)a-synuclein和tau N368共表達(dá)情況。采用免疫組織化學(xué)和Western blot方法檢測(cè)各組動(dòng)物中腦黑質(zhì)、紋狀體、海馬磷酸化a-synuclein和tau N368表達(dá)水平。結(jié)果三種PD動(dòng)物模型中腦黑質(zhì)致密部TH陽(yáng)性神經(jīng)元數(shù)目明顯減少,提示PD模型造模成功。免疫熒光雙標(biāo)法檢測(cè)發(fā)現(xiàn)魚藤酮誘導(dǎo)的PD小鼠模型中腦黑質(zhì)部位a-synuclein和tau N368存在共表達(dá)現(xiàn)象,且表達(dá)水平較對(duì)照組顯著增加,而在海馬和皮層中未發(fā)現(xiàn)顯著的共表達(dá)現(xiàn)象：魚藤酮PD小鼠模型海馬CA1區(qū)a-synuclein和tau N368表達(dá)與正常組相比未見明顯變化,而皮層tau N368表達(dá)較對(duì)照組明顯增多。MPTP誘導(dǎo)的小鼠PD模型黑質(zhì)和海馬CA1區(qū)tau N368表達(dá)增多,而在相同解剖部位的a-synuclein表達(dá)未見明顯變化;皮層的a-synuclein和tau N368表達(dá)組間均未見顯著變化。免疫組化提示魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型紋狀體a-synuclein和tau N368表達(dá)均較對(duì)照組明顯增多,中腦黑質(zhì)磷酸化a-synuclein表達(dá)增多,同時(shí)黑質(zhì)和海馬tauN368表達(dá)組間未見顯著性差異。在模型組Western blot檢測(cè)同時(shí)發(fā)現(xiàn)三種PD動(dòng)物模型紋狀體磷酸化a-synuclein (Ser129)和tau N368表達(dá)水平均較對(duì)照組增加,而在黑質(zhì)和海馬中表達(dá)存在不一致性：MPTP誘導(dǎo)的PD小鼠模型黑質(zhì)和海馬tau N368表達(dá)較對(duì)照組升高,而p-a-synuclein(S129)表達(dá)無(wú)明顯變化：魚藤酮誘導(dǎo)PD小鼠模型海馬p-a-synuclein(S129)和tau N368表達(dá)與對(duì)照組相比均未見明顯變化；魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型海馬p-a-synuclein(S129)表達(dá)較對(duì)照組增加,而tau N368的表達(dá)無(wú)明顯變化。結(jié)論P(yáng)D動(dòng)物模型的中腦黑質(zhì)和紋狀體存在AEP激活后特異性切割tau蛋白現(xiàn)象,所特異性切割的tau蛋白片段N368和a-synuclein在紋狀體或黑質(zhì)存在共表達(dá),提示AEP及其特異性切割作用可能參與了帕金森的發(fā)病過程。第三部分7,8-DHF通過調(diào)節(jié)AEP表達(dá)及其切割效應(yīng)對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型的保護(hù)作用研究目的研究酪氨酸受體激酶B (tyrosine receptor kinase B, TrkB)激動(dòng)劑7,8-DHF對(duì)魚藤酮誘導(dǎo)的PD大鼠模型的保護(hù)作用及作用機(jī)制。方法將36只9月齡的SD大鼠隨機(jī)分為三組：分布為照組(10只),模型組(13只),7,8-DHF干預(yù)組(13只)。給予PD模型組和干預(yù)組大鼠背部皮下注射魚藤酮(2mg/kg/day),連續(xù)注射5周：對(duì)照組按同樣方式給予同等體積的溶媒(如DMSO和玉米油混合液)背部皮下注射；自造模開始給予干預(yù)組大鼠7,8-DHF干預(yù)5周,5mg/kg/day, i.p.).采用曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)評(píng)估PD大鼠的行為學(xué)：酪氨酸羥化酶TH免疫組織化學(xué)及免疫熒光評(píng)估大鼠黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元和紋狀體神經(jīng)纖維的完整性；免疫組化檢測(cè)黑質(zhì)p-TrkB (Y816)表達(dá)水平;Western blot法檢測(cè)各組大鼠中腦黑質(zhì)和紋狀體TH、BDNF、p-TrkB/TrkB、p-MAPK/MAPK、p-Akt (S473)/Akt、AEP、 p-tau(S396)、p-a synuclein (S129)、a-synuclein和tau N368的表達(dá)變化。結(jié)果魚藤酮造模后,曠場(chǎng)實(shí)驗(yàn)組中模型組大鼠運(yùn)動(dòng)距離較正常組明顯減少,給予7,8-DHF干預(yù)可改善魚藤酮誘導(dǎo)的PD模型運(yùn)動(dòng)障礙。TH免疫熒光發(fā)現(xiàn)干預(yù)組大鼠黑質(zhì)TH陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)較模型明顯增多(P0.05),紋狀體TH免疫組織化學(xué)提示7,8-DHF能夠保護(hù)PD模型紋狀體多巴胺能神經(jīng)纖維的完整性。模型組大鼠黑質(zhì)和紋狀體的p-a-synuclein (Ser129)、p-tau(S396)、AEP表達(dá)及特異性切割產(chǎn)物tau N368表達(dá)均較正常組和干預(yù)組升高(P0.05)。與模型組相比較,干預(yù)組黑質(zhì)p-TrkB/TrkB及p-Akt/Akt水平顯著升高,p-MAPK/MAPK水平下降,紋狀體及黑質(zhì)AEP、 p-a-synuclein (Ser 129)、a-synuclein、p-tau(S396)及tau N368的表達(dá)減少(P0.05)。結(jié)論7,8-DHF能夠改善魚藤酮誘導(dǎo)PD模型大鼠的運(yùn)動(dòng)障礙,可能通過激活TrkB受體及下游信號(hào)通路Akt,降低MAPK、a-synuclein和tau的異常磷酸化水平,抑制AEP表達(dá)及其特異性切割作用,發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R742.5;R-332

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本文編號(hào)：1479612