本文關(guān)鍵詞： 衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞 容量激活氯電流 鈣離子 TMEM16A 磷脂酶C　出處：《河北醫(yī)科大學(xué)》2014年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：作為外周神經(jīng)節(jié)中一種重要的神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞(satelliteglial cells, SGCs)越來越多的受到人們的關(guān)注，它不僅可以為神經(jīng)元提供營養(yǎng)及結(jié)構(gòu)的支持，近來人們還發(fā)現(xiàn)它們參與了與神經(jīng)元之間的信息交流，對神經(jīng)元的興奮性產(chǎn)生了影響。因此，衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞對神經(jīng)元生理和病理狀態(tài)的影響成為了研究者關(guān)注的焦點(diǎn)之一。在神經(jīng)元與衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞的信息交流中，容量激活的氯通道可能發(fā)揮著很重要的作用，因?yàn)槿萘考せ盥韧ǖ赖拈_放可能影響著神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞間谷氨酸的釋放,進(jìn)而影響了神經(jīng)元的興奮性，這一神經(jīng)活動與疼痛的發(fā)生有著密切的聯(lián)系。 容量激活的氯電流(volume-acticated chloride currents，Iclswell)屬于氯通道電流的一種。氯離子通道是體內(nèi)最重要的陰離子通道，廣泛分布于各種組織，參與機(jī)體各種病理和生理過程,包括心率的形成、細(xì)胞的增殖和分化、細(xì)胞體積的調(diào)控以及細(xì)胞凋亡等。但是人們對其分子結(jié)構(gòu)、調(diào)節(jié)機(jī)制、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的認(rèn)識還相對較少。對神經(jīng)系統(tǒng)容量激活氯通道的全面認(rèn)識有利于我們發(fā)現(xiàn)一些疾病包括疼痛的基本病理過程，為進(jìn)一步的治療提供可靠靶點(diǎn)。 第一部分衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活氯電流的表達(dá)及分子基礎(chǔ)研究 目的：了解大鼠背跟神經(jīng)節(jié)（DRG）衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上是否存在容量激活氯電流，及其分子基礎(chǔ)。 方法：（1）全細(xì)胞膜片鉗技術(shù)記錄大鼠DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活氯電流；（2）螯合細(xì)胞內(nèi)鈣離子，阻斷細(xì)胞膜嘌呤受體等方法探明容量激活氯電流的激活機(jī)制；（3）慢病毒siRNA特異性敲除衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上的TMEM16A分子，研究容量激活氯電流與TMEM16A表達(dá)的關(guān)系。 結(jié)果： 1大鼠背根神經(jīng)節(jié)衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)容量激活的氯離子電流。 全細(xì)胞膜片鉗實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，高滲電極內(nèi)液條件下，在holding電壓為-60mV下，在大鼠DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞可以觀察到一內(nèi)向電流。100μM鞣酸（Tannic acid，，TA，氯離子通道阻斷劑）可以阻斷該電流。當(dāng)將高滲細(xì)胞內(nèi)液CsCl2中的Cl-用SO2-4代替后，高滲內(nèi)液誘導(dǎo)的內(nèi)向電流消失。 2衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活的氯離子電流的激活與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放有關(guān)。 將高滲細(xì)胞內(nèi)液中的低濃度EGTA分別用高濃度的BAPTA和高濃度的EGTA替代時(shí)，在膜片鉗下記錄，當(dāng)電壓holding在-60mV時(shí)，隨著細(xì)胞體積不斷增加而出現(xiàn)的內(nèi)向電流分別下降了96.9%±2.5%(P0.01, n=9)和80.8%±17.2%(P0.01, n=8)。 3容量激活氯離子電流的激活與ATP受體激活有關(guān) 在衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上，待容量激活的氯電流穩(wěn)定后，給予100μM的蘇拉明（suramin，P2受體阻斷劑）后電流與給藥之前相比下降了34.8%±2.0%(P0.01, n=5)。 4衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上容量激活的氯電流的分子基礎(chǔ)可能是TMEM16A 接下來我們用siRNA慢病毒特異性地敲除衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上的TMEM16A，再用上述的高滲內(nèi)液在膜片鉗下記錄容量激活的氯電流，與對照組相比，轉(zhuǎn)染TMEM16A siRNA的膠質(zhì)細(xì)胞的容量激活的氯電流下降了79.6%±10%(P0.01，n=8)。 結(jié)論：通過膜片鉗實(shí)驗(yàn)，發(fā)現(xiàn)大鼠DRG衛(wèi)星膠質(zhì)細(xì)胞上存在容積激活的氯電流，其激活可能與細(xì)胞內(nèi)鈣離子的釋放有關(guān)。這種容量依賴的氯電流的分子基礎(chǔ)可能是TMEM16A。 第二部分背根神經(jīng)節(jié)中磷脂酶C的表達(dá) 目的：研究在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中磷脂酶C (Phospholipase C, PLC)的表達(dá)特征，為進(jìn)一步研究磷脂酶C是否參與了容量激活氯電流的激活過程奠定基礎(chǔ)。 方法：RT-PCR; western blotting;免疫熒光。 結(jié)果： 1PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中，四種PLC-β亞型的mRNA表達(dá)水平，以PLC-β3的表達(dá)水平最高，PLC-β4和PLC-β1次之，PLC-β2的基因表達(dá)水平最低。 2免疫熒光結(jié)果 在大鼠背根神經(jīng)節(jié)中，PLC-β3、PLC-β4均大量的表達(dá)于DRG神經(jīng)元上，且可以與標(biāo)記中小神經(jīng)元的IB4共表達(dá)，但是并不僅僅表達(dá)于中小神經(jīng)元。另外，PLC-β1、β2在DRG神經(jīng)元中表達(dá)量較少。 3Western blotting實(shí)驗(yàn)結(jié)果 在大鼠DRG神經(jīng)節(jié)中，PLC-β1、β2、β3、β4蛋白均有表達(dá)。 結(jié)論：實(shí)驗(yàn)初步確定PLC-β3和PLC-β4的表達(dá)水平較高，應(yīng)該作為我們下一步探明容量激活氯電流信號通路的關(guān)鍵磷脂酶C亞型。
[Abstract]:As a kind of important glial cells in peripheral ganglia in satellite glial cells (satelliteglial, cells, SGCs) is attracting more and more attention, it can not only provide nutrients and structural support for neurons, recently found that they participated in the exchange of information between God and element, on neuronal excitability produced the effect of impact. Therefore, satellite glial cells on neuronal physiological and pathological condition has become the focus of attention of researchers. In the information exchange of neurons and satellite glial cells in the activated chloride channel capacity may play a very important role, because the volume activated chloride channel opening may affect neurons and glial cells between the release of glutamate, thereby affecting the excitability of neurons, the neural activity and the occurrence of pain are closely linked.
Volume activated chloride current (volume-acticated chloride, currents, Iclswell) is a kind of chloride channel currents. Chloride channel is the most important in the anion channel, widely distributed in various organizations, participate in various pathological and physiological process of the body, including the heart rate formation, cell proliferation and differentiation, cell volume regulation and apoptosis but people the regulation mechanism of the molecular structure, and understanding of the signal transduction pathway is relatively small. We can find some diseases including the basic pathological process of pain on the comprehensive understanding of the nervous system volume activated chloride channels, provide a reliable target for further treatment.
Part 1 expression of capacity activated chlorine current on glial cells and molecular basis study
Objective: To investigate whether there is a capacity activating chlorine current and its molecular basis on the rat dorsal heel ganglion (DRG) satellite glial cells.
Methods: (1) whole cell patch clamp recording in rat DRG satellite glial cell volume activated chloride current; (2) chelation of intracellular calcium, activation of purinergic receptor blocking cell membrane method and explore the capacity of activated chloride currents; (3) lentiviral siRNA specific knockdown of TMEM16A molecules in satellite glial cells the study of the relationship between the expression of activated chloride current and the capacity of TMEM16A.
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本文編號：1477436