本文關(guān)鍵詞： 神經(jīng)組織定向干細(xì)胞 感覺(jué)神經(jīng)元 背根神經(jīng)節(jié) 移植 神經(jīng)再生　出處：《第二軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：臨床患者常見(jiàn)的腰部及下肢放射性痛多由腰椎間盤突出癥、腰椎管狹窄、腰骶椎不穩(wěn)定等原因造成的脊神經(jīng)根受壓所致，嚴(yán)重者可以造成患肢的運(yùn)動(dòng)功能喪失。椎板開窗、髓核摘除、神經(jīng)根減壓等手術(shù)治療，雖然可以使患者的運(yùn)動(dòng)功能及疼痛癥狀得到緩解，但患肢的麻木等感覺(jué)功能障礙卻難以恢復(fù)，這成為長(zhǎng)期困擾臨床醫(yī)生的棘手問(wèn)題。 神經(jīng)損傷后感覺(jué)功能受損的主要表現(xiàn)是患者的痛覺(jué)、溫度覺(jué)障礙以及繼發(fā)性的感覺(jué)性共濟(jì)運(yùn)動(dòng)失調(diào)。此外，感覺(jué)神經(jīng)元構(gòu)成神經(jīng)系統(tǒng)反射弧的傳入路徑，因此還可能造成各種生理性的反射功能喪失等嚴(yán)重后果。如陰部神經(jīng)的感覺(jué)功能缺損，可造成肛門反射異常而引起大便失禁；盆內(nèi)臟神經(jīng)的感覺(jué)功能缺損，可造成病人膀胱反射消失而引起尿潴留等一系列臨床癥狀�？梢�(jiàn)，神經(jīng)損傷后，修復(fù)患者的感覺(jué)功能，是提高神經(jīng)修復(fù)效果、改善患者生活質(zhì)量，必須重視的問(wèn)題。 通過(guò)再生醫(yī)學(xué)移植神經(jīng)干細(xì)胞修復(fù)神經(jīng)損傷是公認(rèn)的有效方法和手段，但目前注意點(diǎn)主要集中在損傷神經(jīng)的運(yùn)動(dòng)功能恢復(fù)方面，對(duì)感覺(jué)功能的恢復(fù)缺乏重視。本課題擬通過(guò)成體干細(xì)胞源性感覺(jué)神經(jīng)元移植，探討修復(fù)感覺(jué)缺損的可能性及機(jī)制。 通過(guò)再生醫(yī)學(xué)移植神經(jīng)干細(xì)胞的方法修復(fù)周圍感覺(jué)神經(jīng)缺損，首先必須解決移植細(xì)胞的種類、來(lái)源，和誘導(dǎo)分化為感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞的問(wèn)題。 骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞（neural tissue committed stem cells，NTCSCs），是骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的一種亞型，或組分，可以自然分化為神經(jīng)元細(xì)胞。NTCSCs可來(lái)源于自體、無(wú)倫理學(xué)爭(zhēng)議、避免了免疫排斥反應(yīng)，并且取材容易，活性好，易于誘導(dǎo)分化，應(yīng)是較為理想的移植用種子細(xì)胞來(lái)源。我們實(shí)驗(yàn)室前期成功分離、培養(yǎng)了NTCSCs，并誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞，，用于修復(fù)周圍神經(jīng)缺損，取得了初步研究成果，但，由于該干細(xì)胞存在一定爭(zhēng)議，應(yīng)用研究較少涉及。 Kondo T等通過(guò)Forskolin（腺苷酸環(huán)化酶激活劑）和成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子-2（fibroblast growth factor-2，F(xiàn)GF2）預(yù)誘導(dǎo)，再經(jīng)音猥因子(sonic hedgehog，SHH)和維甲酸（retinoic acid，RA）的聯(lián)合誘導(dǎo)，可以將C57小鼠的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal Stem Cells，MSCs）誘導(dǎo)分化為特異性表達(dá)VGluT1（Ⅰ型囊泡膜谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)體）、calretinin（鈣結(jié)合蛋白）、P2X3（ATP調(diào)控的一種離子通道受體）等谷氨酸能感覺(jué)神經(jīng)元特異性標(biāo)志蛋白的細(xì)胞，且可以在腦源性神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子（Brain-derived neurotrophic factor，BDNF）存在的微環(huán)境中長(zhǎng)期存活。這為我們通過(guò)骨髓NTCSCs獲得大量穩(wěn)定的可移植用的感覺(jué)神經(jīng)元提供了借鑒依據(jù)。 通過(guò)移植感覺(jué)神經(jīng)元的方法修復(fù)周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損，還需要找到適宜的周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損的動(dòng)物模型。脊神經(jīng)節(jié)內(nèi)聚集著假單極感覺(jué)性神經(jīng)元，這種感覺(jué)神經(jīng)元負(fù)責(zé)接收來(lái)自軀體和四肢的感覺(jué)信息，并進(jìn)一步傳遞至中樞神經(jīng)。背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元是一種終末分化神經(jīng)細(xì)胞，一旦死亡，不能再生，從而造成肢體的感覺(jué)功能出現(xiàn)異常。Helgren等采用腹腔注射過(guò)量吡哆醇的方法導(dǎo)致神經(jīng)纖維軸索變性及背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元的壞死。后續(xù)研究證明，通過(guò)注射過(guò)量吡哆醇制作感覺(jué)神經(jīng)病動(dòng)物模型的方法簡(jiǎn)單、操作性強(qiáng)、重復(fù)性好，是目前神經(jīng)科學(xué)領(lǐng)域研究感覺(jué)神經(jīng)病的常用模型。 綜上所述，本課題擬在成功制備背根神經(jīng)節(jié)病變大鼠動(dòng)物模型基礎(chǔ)上，研究同種異體骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞移植，修復(fù)感覺(jué)神經(jīng)缺損的效果與機(jī)制，探討成體干細(xì)胞源性感覺(jué)神經(jīng)元移植，修復(fù)感覺(jué)神經(jīng)缺損的可行性，為臨床治療周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損提供理論和實(shí)驗(yàn)依據(jù)。 第一部分骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元的分離、培養(yǎng)、誘導(dǎo)分化及鑒定 研究目的：獲取移植應(yīng)用所需的骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞。 材料和方法：從成年SD大鼠骨髓組織中分離獲得單個(gè)核細(xì)胞，采用先貼壁培養(yǎng)篩選、后無(wú)血清神經(jīng)干細(xì)胞培養(yǎng)液懸浮培養(yǎng)的方式，分離、擴(kuò)增出單克隆生長(zhǎng)的NTCSCs；對(duì)得到的NTCSCs進(jìn)行鑒定；擴(kuò)增得到的NTCSCs采用SHH和RA等聯(lián)合誘導(dǎo)的方法使其向感覺(jué)神經(jīng)元方向分化；對(duì)得到的骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元進(jìn)行鑒定。 結(jié)果：SD大鼠骨髓組織中的單個(gè)核細(xì)胞采用單細(xì)胞克隆、無(wú)血清懸浮培養(yǎng)得到大量的神經(jīng)球；神經(jīng)球細(xì)胞表達(dá)神經(jīng)干細(xì)胞特異蛋白Nestin和組織定向干細(xì)胞特異蛋白CXCR4，同時(shí)具有MSCs表型特征：CD29（97.81%）、CD44（91.31%）、CD90（93.85%）、CD105（95.08%）、CD34（3.78%）、CD45（1.59%）；超微結(jié)構(gòu)顯示多個(gè)核仁、豐富的線粒體、常染色質(zhì)較多等干細(xì)胞特征。神經(jīng)球細(xì)胞經(jīng)SHH和RA聯(lián)合誘導(dǎo)后表現(xiàn)神經(jīng)元樣細(xì)胞外形特征，并且表達(dá)NeuN、MAP-2、β-tublinⅢ、GluR-4等蛋白；Gria4、Gria3、Calb2、Pou4f1、Tau、NeuN、MAP-2、Tubulin Ⅲ、NF、GFAP、Neurogenin2等基因表達(dá)上調(diào)，Nestin、Ret、GATA3等基因表達(dá)下調(diào)；Tau、MAP-2、NF、NSE、NeuN、Gria4等蛋白表達(dá)量增加，Nestin蛋白表達(dá)降低。 結(jié)論：骨髓組織中存在NTCSCs，可以分離，并能通過(guò)細(xì)胞球懸浮培養(yǎng)的方法得到大量擴(kuò)增；NTCSCs在SHH和RA的聯(lián)合誘導(dǎo)作用下可以分化為具有谷氨酸能特征的感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞。 第二部分周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損動(dòng)物模型的建立 研究目的：建立周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損動(dòng)物模型。 材料和方法：成年雌性SD大鼠，體重180-220g，采用早晚兩次，連續(xù)8天，腹腔注射800mg/kg/d吡哆醇鹽酸鹽，進(jìn)行周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損動(dòng)物模型的制作。通過(guò)動(dòng)物功能行為學(xué)、神經(jīng)電生理學(xué)、受損背根神經(jīng)節(jié)及坐骨神經(jīng)的組織形態(tài)學(xué)觀察與計(jì)量等實(shí)驗(yàn)方法，對(duì)得到的動(dòng)物模型進(jìn)行綜合性評(píng)價(jià)。 結(jié)果：造模后動(dòng)物步態(tài)蹣跚、平衡及穩(wěn)定性較差；足底溫度覺(jué)和痛覺(jué)敏感度降低；坐骨神經(jīng)感覺(jué)潛伏期延長(zhǎng)，傳導(dǎo)速度降低；背根神經(jīng)節(jié)的神經(jīng)元萎縮、變性、壞死，神經(jīng)纖維軸索變性，排列疏松紊亂，伴有髓鞘塌陷、扭曲等。 結(jié)論：通過(guò)腹腔注射過(guò)量吡哆醇的方法可以制作周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損動(dòng)物模型。 第三部分骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元移植修復(fù)大鼠周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損的作用與機(jī)制 研究目的：探討骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元樣細(xì)胞移植修復(fù)SD大鼠周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損的作用與機(jī)制。 材料和方法：采用顯微注射的方法，將CM-Dil標(biāo)記的骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元細(xì)胞，移植進(jìn)入吡哆醇誘導(dǎo)的感覺(jué)缺損模型動(dòng)物的L4、L5背根神經(jīng)節(jié)內(nèi)。分別于移植術(shù)后第2周、4周、8周、12周對(duì)模型動(dòng)物進(jìn)行行為學(xué)觀察；感覺(jué)功能評(píng)測(cè)；坐骨神經(jīng)電生理學(xué)檢測(cè)；坐骨神經(jīng)及背根神經(jīng)節(jié)形態(tài)學(xué)觀察及計(jì)量學(xué)分析；熒光金（FG）逆行示蹤等實(shí)驗(yàn)方法與手段，觀測(cè)移植的感覺(jué)神經(jīng)元對(duì)模型動(dòng)物感覺(jué)功能的修復(fù)情況。 結(jié)果：移植骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元后，模型動(dòng)物的一般姿勢(shì)、動(dòng)作步態(tài)隨時(shí)間的延長(zhǎng)出現(xiàn)明顯好轉(zhuǎn)的跡象；足底溫度覺(jué)和痛覺(jué)敏感度逐漸恢復(fù)；坐骨神經(jīng)有髓神經(jīng)纖維計(jì)數(shù)明顯增加，感覺(jué)潛伏期縮短、感覺(jué)神經(jīng)傳導(dǎo)速度增加，且與時(shí)間線性相關(guān)；免疫熒光染色CM-Dil標(biāo)記的骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元在DRG內(nèi)遷移、定植，并表達(dá)NeuN和GluR-4蛋白；DRG內(nèi)檢測(cè)到FG標(biāo)記的神經(jīng)元細(xì)胞數(shù)量顯著增多。 結(jié)論：移植骨髓NTCSCs源性感覺(jué)神經(jīng)元可以有效修復(fù)周圍神經(jīng)感覺(jué)缺損。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第二軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號(hào)】：R745

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前9條

1 彭建平;寇玉輝;鄧玖旭;張培訓(xùn);殷曉鋒;姜保國(guó);;單純感覺(jué)/運(yùn)動(dòng)神經(jīng)纖維動(dòng)物模型的制作及鑒定[J];北京大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2013年05期

2 任叢莉;張志英;李亮;張傳森;黨瑞山;;骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的分離培養(yǎng)鑒定[J];解剖學(xué)雜志;2007年04期

3 任叢莉;張志英;張傳森;劉芳;孫瑜;李瑞;張喜;李亮;;骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞性組織工程化神經(jīng)移植修復(fù)坐骨神經(jīng)損傷[J];解剖學(xué)雜志;2008年01期

4 任叢莉;張志英;劉芳;張傳森;李亮;;骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞性組織工程化神經(jīng)的構(gòu)建[J];解剖學(xué)雜志;2009年01期

5 武京國(guó);謝方南;馬慧雨;王黔;曹誼林;肖苒;;EGFP和CM-Dil示蹤骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞構(gòu)建組織工程骨的體內(nèi)研究[J];中國(guó)美容醫(yī)學(xué);2012年03期

6 李琳;張興秀;王健;姜容;鄭敏;;腦缺血后移植骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞的分布與分化[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2012年11期

7 張瑩瑩;梁耕田;劉莉;盧嶺;劉金炎;;骨髓神經(jīng)組織定向干細(xì)胞移植修復(fù)聽(tīng)神經(jīng)損傷模型大鼠的實(shí)驗(yàn)研究[J];山東大學(xué)耳鼻喉眼學(xué)報(bào);2013年05期

8 陳志強(qiáng);韓新煥;曹新;;Sonic Hedgehog信號(hào)通路與內(nèi)耳發(fā)育調(diào)控[J];遺傳;2013年09期

9 段大鵬;蘇權(quán);胡偉;尤武林;黨曉謙;王坤正;;同種異體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞移植治療大鼠脊髓損傷的時(shí)效性分析[J];中國(guó)骨傷;2013年10期

本文編號(hào)：1476812