本文關(guān)鍵詞： 癲癇 線粒體分裂 動(dòng)力相關(guān)蛋白1 線粒體分裂蛋白抑制劑 細(xì)胞凋亡 神經(jīng)保護(hù)　出處：《鄭州大學(xué)》2015年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：研究背景癲癇是多種病因所引起的反復(fù)發(fā)作的大腦神經(jīng)元高度同步異常放電所致的腦功能失調(diào)為特征的慢性腦部疾病。癲癇的長(zhǎng)期發(fā)作不僅對(duì)病人的生活質(zhì)量產(chǎn)生嚴(yán)重的影響,而且對(duì)患者家庭及社會(huì)將會(huì)增加沉重的負(fù)擔(dān)。癲癇發(fā)作可以導(dǎo)致神經(jīng)元損傷,而神經(jīng)元損傷又會(huì)明顯增加其后癲癇發(fā)作的危險(xiǎn)性,但是目前,癲癇發(fā)作導(dǎo)致神經(jīng)元損傷的機(jī)制尚不完全清楚,而且針對(duì)癲癇發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)損傷的神經(jīng)保護(hù)策略還很有限。線粒體作為真核生物細(xì)胞內(nèi)具有兩層膜的細(xì)胞器,在有氧氧化能量代謝,細(xì)胞信號(hào)分子傳導(dǎo)和細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮著整合平臺(tái)的作用。由于神經(jīng)細(xì)胞是生物體內(nèi)能量代謝需求旺盛的細(xì)胞,所以尤其依賴線粒體的功能。近年來(lái)的癲癇研究中,線粒體功能障礙引起了極大的關(guān)注�；铙w細(xì)胞內(nèi)的線粒體不斷地進(jìn)行著分裂/融合,是一個(gè)不斷變化的細(xì)胞器。線粒體融合使線粒體變?yōu)殚L(zhǎng)管狀網(wǎng)狀結(jié)構(gòu),線粒體分裂促使線粒體網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)瓦解為片斷。正常情況下,線粒體分裂和融合之間的動(dòng)態(tài)平衡導(dǎo)致線粒體網(wǎng)絡(luò)狀結(jié)構(gòu)和形態(tài)不斷地發(fā)生著的重塑和變化,從而適應(yīng)不同的生理活動(dòng)需要。線粒體動(dòng)態(tài)的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)對(duì)各種病理生理性刺激高度敏感,諸如氧化應(yīng)激,缺血,老齡等異常病理情況均有可能導(dǎo)致線粒體分裂融合失衡。近來(lái)的研究關(guān)注到,線粒體分裂/融合紊亂在諸如肌萎縮側(cè)索硬化,亨廷頓病,阿爾海默氏病及帕金森病等神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病的線粒體自噬,神經(jīng)元損傷和凋亡等病理過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。Drp1(dynamin-related protein 1)即動(dòng)力相關(guān)蛋白1,是調(diào)控真核細(xì)胞線粒體分裂的關(guān)鍵蛋白。Mdivi-1(mitochondrial division inhibitor)通過(guò)失活三磷酸鳥(niǎo)苷(guanosine triphosphate,GTP)酶,選擇性地抑制動(dòng)力相關(guān)蛋白1,從而發(fā)揮抑制線粒體分裂的作用。已經(jīng)證實(shí)線粒體的氧化應(yīng)激損傷參與癲癇的病理過(guò)程,但是目前,線粒體分裂在癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷中的作用尚不清楚,線粒體分裂抑制劑Mdivi-1對(duì)癲癇發(fā)作導(dǎo)致的神經(jīng)損傷是否具有神經(jīng)保護(hù)作用及具體機(jī)制如何至今很少有報(bào)道。研究目的本研究通過(guò)建立的氯化鋰-匹羅卡品癲癇模型,觀察致癇及Mdivi-1預(yù)處理大鼠行為學(xué),神經(jīng)元缺失,細(xì)胞凋亡,海馬神經(jīng)元線粒體Drp1及凋亡相關(guān)物質(zhì)細(xì)胞色素C、凋亡誘導(dǎo)因子AIF和半胱天冬酶3表達(dá)水平變化,研究線粒體分裂在癲癇神經(jīng)元損傷中的作用,探討癲癇神經(jīng)元損傷的相關(guān)保護(hù)機(jī)制。材料與方法雄性健康成年的96只SD大鼠,體重在200-250g,隨機(jī)分成正常對(duì)照組(CON組),匹羅卡品組(PILO組),匹羅卡品+二甲基亞砜陰性對(duì)照組(PILO+DMSO組),Mdivi-1干預(yù)組(PILO+Mdivi-1)組四組,PILO組,PILO+DMS組和PILO+Mdivi-1組三組大鼠腹腔注射氯化鋰(127mg/kg)-匹羅卡品(30mg/kg)誘導(dǎo)癲癇持續(xù)狀態(tài)癲癇。在注射匹羅卡品前30min,PILO+Mdivi-1和PILO+DMSO組組分別給予腹腔注射Mdivi-1(1.2mg/kg)和0.1%的二甲基亞砜(DMSO),CON組的大鼠給予等體積生理鹽水用來(lái)代替匹羅卡品、二甲基亞砜及Mdivi-1。SE發(fā)作1h時(shí),使用地西泮(10mg/kg)腹腔注射終止大鼠的癲癇發(fā)作。按照Racine標(biāo)準(zhǔn)對(duì)癇性發(fā)作級(jí)別進(jìn)行判斷,分別記錄造模成功大鼠的潛伏期及致癇成功率。SE發(fā)作后24h,處死大鼠前對(duì)其腦電圖進(jìn)行描記,繼之麻醉大鼠后進(jìn)行斷頭取腦,大鼠的雙側(cè)海馬被迅速地分離出來(lái)。大鼠海馬Drp1 mRNA的表達(dá)水平使用RT-PCR法進(jìn)行檢測(cè),大鼠海馬Drp1、caspase-3、CytC和AIF的蛋白表達(dá)水平使用Western blot方法進(jìn)行檢測(cè)。SE后72h時(shí),麻醉其余大鼠后,進(jìn)行斷頭取腦。使用Nissl染色對(duì)大鼠海馬神經(jīng)元的缺失及損傷狀況進(jìn)行觀測(cè),使用TUNEL法對(duì)大鼠海馬細(xì)胞凋亡情況進(jìn)行觀察。在本研究中,采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)來(lái)表示所有的研究數(shù)據(jù)資料,應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。應(yīng)用卡方檢驗(yàn)(Chi-Square Tests)對(duì)致癇成功率進(jìn)行比較,其余使用單因素方差分析(one-way analysis of variance)對(duì)組間數(shù)據(jù)進(jìn)行比較,兩組間比較采用LSD(Least—SignificantDifference)-t檢驗(yàn),以α=0.05作為研究的顯著性水準(zhǔn)。結(jié)果:1:大鼠的行為學(xué)表現(xiàn)及腦電圖描記結(jié)果:正常對(duì)照組大鼠行為表現(xiàn)正常,無(wú)癇性發(fā)作,腦電圖的描記結(jié)果正常;依據(jù)Racine標(biāo)準(zhǔn)的癲癇發(fā)作分級(jí),在PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠腹腔注射匹羅卡品以后,其癲癇發(fā)作級(jí)別可以達(dá)到Ⅳ-Ⅴ級(jí),甚至出現(xiàn)癲癇持續(xù)狀態(tài);三組大鼠之間的發(fā)作潛伏期及致癇成功率無(wú)顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05);匹羅卡品腹腔注射后,三組大鼠的腦電圖描記到大量的高波幅的尖波、棘波,棘慢及尖慢綜合波發(fā)放。2.病理學(xué)觀察結(jié)果:2.1 Nissl染色觀察結(jié)果:SE后72h時(shí),與正常對(duì)照組相比,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠海馬CA3區(qū)的神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)明顯減少,可以發(fā)現(xiàn)有明顯的神經(jīng)元缺失統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性的差異(p0.05);在SE后72h時(shí),與PILO組相比,PILO+DMSO組大鼠的海馬CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)減少,統(tǒng)計(jì)學(xué)無(wú)顯著性的差異(p0.05);PILO+Mdivi-1組大鼠海馬的CA3區(qū)神經(jīng)元數(shù)目出現(xiàn)明顯的增多,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性的差異(p0.05)。2.2細(xì)胞凋亡TUNE法檢測(cè)結(jié)果:在SE后72h時(shí),與正常對(duì)照組比,PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠的海馬CA3區(qū)存在有明顯的細(xì)胞凋亡,有顯著性的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。在SE后72h時(shí),與PILO組相比,PILO+DMSO組大鼠海馬CA3區(qū)的細(xì)胞凋亡出現(xiàn)增多,無(wú)顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05),PILO+Mdivi-1組大鼠的海馬CA3區(qū)的細(xì)胞凋亡數(shù)目出現(xiàn)明顯的減少,有顯著性統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p0.05)。3.Western blot結(jié)果:與正常對(duì)照組相比,SE后24h時(shí),PILO、PILO+DMSO和PILO+Mdivi-1三組大鼠海馬存在有Drp1表達(dá)水平明顯升高,caspase-3顯著激活,CytC異常釋放及AIF不正常移位,統(tǒng)計(jì)學(xué)有顯著性差異(p0.05)。癲癇持續(xù)狀態(tài)發(fā)作后24h時(shí),與PILO組相比,PILO+DMSO組Drp1表達(dá)水平升高,PILO+DMSO組Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活增加,統(tǒng)計(jì)均無(wú)顯著性差異(p0.05),PILO+Mdivi-1組大鼠海馬Drp1表達(dá)水平降低,統(tǒng)計(jì)均無(wú)顯著性差異(p0.05),而Cyt C釋放、AIF移位和caspase-3激活減少,統(tǒng)計(jì)有顯著性差異(p0.05)。4.RT-PCR結(jié)果:與CON組相比,在SE發(fā)作后24h時(shí)PILO組、PILO+DMSO組和PILO+Mdivi-1組三組大鼠海馬Drp1 mRNA表達(dá)水平顯著升高,差異有顯著性(p0.05);SE后24h時(shí)與PILO組相比,PILO+DMS組及PILO+Mdivi-1組Drp1 mRNA表達(dá)水平降低。統(tǒng)計(jì)均無(wú)顯著性差異(p0.05)。結(jié)論1.大鼠海馬神經(jīng)元Drp1及Drp1 mRNA的表達(dá)水平在癲癇持續(xù)狀態(tài)后出現(xiàn)明顯的增高,提示線粒體分裂很可能參與到了癲癇的病理?yè)p傷過(guò)程。2:線粒體分裂蛋白抑制劑Mdivi-1的神經(jīng)保護(hù)作用可能是通過(guò)阻斷致癇大鼠海馬神經(jīng)元凋亡時(shí)caspase-3顯著激活,Cyt C異常釋放及AIF不正常移位和來(lái)實(shí)現(xiàn);抑制線粒體分裂有可能成為癲癇發(fā)作后神經(jīng)損傷新的治療策略。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R742.1

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本文編號(hào)：1467119