發(fā)布時間：2018-01-26 12:28

  本文關鍵詞： TOLL樣受體4 聚肌胞酸 缺血再灌注 TOLL樣受體3 TOLL樣受體4信號　出處：《第三軍醫(yī)大學》2014年博士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：背景與目的：缺血性腦卒中是由腦部血液循環(huán)障礙導致局部神經(jīng)功能缺失為特征的一組疾病，是目前嚴重威脅人類健康的最主要疾病之一，是當今世界最主要致殘和第二大致死疾病。雖歷經(jīng)多年研究，目前有詢證醫(yī)學證據(jù)支持有效的治療方法是發(fā)病后3-4.5h的靜脈溶栓，但受有限時間窗及醫(yī)療條件的限制，很少有卒中患者能得到這種治療措施，因此深入研究有效的防治腦卒中的的方法尤為重要，有重要的臨床意義�，F(xiàn)在認為腦卒中有效治療方法的匱乏主要原因是卒中的病理生理機制尚不完全清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應在腦缺血繼發(fā)性腦損傷中扮有重要作用。 天然免疫系統(tǒng)是細菌感染或組織損傷誘導炎癥的主要貢獻者。現(xiàn)已明確TLRs是天然免疫及PRR家族最重要的模式識別受體之一，主要識別細胞外的病原微生物和細胞內(nèi)的吞噬體和溶酶體。現(xiàn)有明確的證據(jù)表明，TLRs還能識別組織損傷釋放的內(nèi)源性分子，稱之為損傷相關的分子模式（DAMPs），從而啟動TLRs信號通路，誘導炎癥反應。TLRs由N端重復的亮氨酸和Toll/IL-1R的跨膜區(qū)域構成。到現(xiàn)在為止，人類已發(fā)現(xiàn)11個TLRs，而小鼠發(fā)現(xiàn)13個TLRs，不同的TLRs識別不同的病原微生物分子模式和自身組織分子。比如，TLR2以及它的異源二聚體TLR1/TLR2、TLR6/TLR2識別細菌和支原體的脂蛋白，TLR3識別病毒雙鏈RNA，TLR4識別革蘭氏陰性細菌細胞壁的主要成分脂多糖（LPS）,TLR7識別RNA病毒的單聯(lián)RNA，TLR9識別細菌或病毒未甲基化的DNA。TLRs表達在各種不同的免疫細胞，比如中性粒細胞、樹狀突細胞、巨噬細胞、B細胞、小膠質細胞，而且TLRs還表達在非免疫細胞上，比如纖維母細胞、上皮細胞、角質細胞、心肌細胞、骨骼肌細胞以及神經(jīng)元細胞。TLRs識別病原相關分子模式或損傷相關的分子模式，啟動TLRs通路，誘導炎癥反應。 現(xiàn)已證實TLRs介導的炎癥反應在腦缺血再灌注損傷方面扮有重要的的角色。通過識別缺血損傷神經(jīng)元釋放的DAMPs，激活TLRs受體，誘導NF-κB依賴的促炎細胞因子和/或干擾素調(diào)節(jié)因子的Ⅰ型干擾素，參與病理生理過程。最近的研究表明，缺血腦組織TLR4mRNA的表達明顯上調(diào)，而且，腦缺血損傷的神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)源性配體可以激活TLR4，通過MyD88依賴性信號途徑激活NF-κB轉錄，產(chǎn)生促炎因子引起神經(jīng)元的變性、凋亡和壞死。我們和其他實驗室發(fā)現(xiàn)，在局灶性MCAO和全腦缺血再灌注損傷模型，TLR4缺陷的小鼠可減小腦梗死體積、減輕腦水腫、降低外周血細胞因子TNF-α、IL-6的水平以及改善神經(jīng)功能評分。最近的研究顯示，修飾TLRs介導的NF-κB信號通路，可以減輕心臟、腦等器官的缺血再灌注損害。近年來發(fā)現(xiàn)TLR（2，4，7，9）配體的預處理，可以增加腦組織對再次缺血的耐受，顯著減小腦梗塞體積，減輕神經(jīng)功能缺損。而且，TLR2配體Pam3csk4后處理也能減輕腦缺血再灌注損害。 TLR3受體識別病毒雙鏈RNA，還可以識別poly-IC，雙鏈RNA模擬物。TLR3被激活后募集調(diào)節(jié)蛋白TRIF，激活TRIF依賴的信號通路誘導IFNs和NF-κB的激活。與野生鼠相比，TLR3敲除鼠沒有減小腦缺血再灌注損傷的腦梗死體積，顯示TLR3不直接參與TLRs通路激活導致的炎癥反應。近期有報道TLR3配體poly-IC預處理對缺血性腦和腎臟再灌注損傷有保護作用，但TLR3配體poly-IC后處理是否有效及機制尚不清楚。 已有報道TLR3配體poly-IC預處理可以下調(diào)巨噬細胞TLR4的表達，抑制LPS誘導的P38-MAPK、PSAPK/JNK信號通路，降低細胞因子TNF-α的水平，從而減輕LPS誘導的肝損害。因此我們主要推測TLR3配體Poly-IC后處理對腦缺血再灌注損傷的也有保護作用，其機制可能通過激活TLR3受體下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路而產(chǎn)生腦缺血保護作用。 我們應用大腦中動脈阻塞（MCAO）小鼠、大鼠模型；離體細胞培養(yǎng)（OGD）模型，評價TLR3配體poly-IC后處理對腦缺血再灌注損傷的治療效果及機制。 方法： 第一部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用 1.建立小鼠MCAO模型，，應用TTC染色，檢測poly-IC預處理，特別是后處理對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護效應，同時檢測腦含水量和神經(jīng)功能評分。 2.野生小鼠MCAO48h后，應用尼氏染色及透射電鏡，檢測各組海馬神經(jīng)元及線粒體的損傷程度；利用ELISA，檢測缺血腦組織、腦脊液和外周血細胞因子TNF-α、IL-1β及IFN-β的水平。 3.野生小鼠MCAO48h后，利用Western blot技術，檢測缺血腦組織的Bcl-2、Bax、Hsp27及Hsp70的表達；利用免疫熒光技術，檢測缺血腦組織的TUNEL及FIB陽性細胞。 第二部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)TLR4信號產(chǎn)生腦缺血保護效應 1. TLR3-/-小鼠MCAO48h后，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，觀察poly-IC后處理對缺血再灌注損傷的效應；利用免疫熒光技術，檢測缺血腦組織的TUNEL及FIB陽性細胞數(shù)。 2.野生小鼠MCAO48h后，利用Western blot及EMSA技術，檢測poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信號分子對TLR4通路的影響；利用ELISA技術，檢測poly-IC治療對LPS刺激小鼠TNF-α及IL-1β水平的影響。 3. TLR4-/-小鼠MCAO48h后，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，觀察poly-IC后處理對缺血再灌注損傷的效應。野生小鼠MCAO48h后，利用TTC染色、Western blot及EMSA技術，檢測腦室注射IFN-β對腦缺血的保護效應及對TLR4信號的影響。 第三部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)小膠質細胞TLR4信號，對海馬神經(jīng)元產(chǎn)生保護效應 1.建立離體細胞培養(yǎng)糖氧剝離（OGD）模型，利用ELISA技術，檢測各組小膠質細胞分泌的TNF-α、IL-1β及IFN-β的水平；利用免疫熒光技術，檢測poly-IC對transwell海馬神經(jīng)元生存率的影響；利用Western blot技術，檢測混合神經(jīng)元-膠質細胞Bcl-2、Bax的表達。 2.小膠質細胞OGD24h后，利用Western blot及EMSA技術，檢測poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信號分子對TLR4通路的影響；利用ELISA技術，檢測poly-IC治療對LPS刺激小膠質細胞TNF-α及IL-1β水平的影響。 3.小膠質細胞OGD24h后，利用Western blot及EMSA技術，檢測封閉TLR3信號后，TLR4信號通路的變化。而且檢測外源性IFN-β對TLR4通路的影響。 第四部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生長期保護作用 1.建立小鼠MCAO模型，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，檢測poly-IC的長期腦缺血保護效應。 2.建立大鼠腦永久腦缺血模型，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，檢測poly-IC對大鼠腦缺血的保護效應。 結果： 第一部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護作用 1．利用小鼠MCAO模型，poly-IC預處理能減小腦梗塞體積、減輕腦水腫及改善神經(jīng)功能評分；重要的是，poly-IC后處理對小鼠腦缺血再灌注損害損害有治療效應。 2.尼氏染色顯示，缺血再灌注組海馬角1區(qū)和齒狀回區(qū)海馬神經(jīng)元結構嚴重損害，主要特征是細胞體濃縮伴有細胞核的固縮。然而，poly-IC治療組，海馬神經(jīng)元的損傷明顯減輕。透射電鏡顯示，缺血再灌注組線粒體外膜嚴重損害伴有不規(guī)則細胞器的形成；與此相對照，poly-IC組線粒體顯示基質水腫，但線粒體的完整性保持完整。ELISA結果顯示，與缺血對照組相比，poly-IC后處理組缺血腦組織、腦脊液及外周血細胞因子TNF-α及IL-1β的水平明顯降低，而IFN-β的水平明顯提高。 3．Western blot結果顯示，與缺血對照組相比，poly-IC后處理組缺血腦組織Bcl-2、HSP27、HSP70表達顯著增高，而Bax水平顯著降低；免疫熒光顯示，poly-IC后處理組缺血腦組織的的TUNEL及FJB陽性細胞明顯減少。 第二部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)TLR4信號產(chǎn)生腦缺血保護效應 1.利用TLR3-/-小鼠MCAO模型，poly-IC的腦缺血的保護效應消失，免疫熒光顯示，與缺血對照組相比，poly-IC后處理組缺血腦組織的的TUNEL及FJB陽性細胞沒有減少。 2. Western blot及EMSA結果顯示，poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3通路的信號分子下調(diào)TLR4通路及NF-κB的活性；ELISA結果顯示，poly-IC治療降低LPS刺激小鼠腦脊液及血液中TNF-α及IL-1β的水平。 3.利用TLR4-/-小鼠MCAO模型，與缺血對照組相比，poly-IC后處理不能進一步減輕腦缺血損害。野生小鼠MCAO模型，腦室注射IFN-β能減小腦梗塞體積及下調(diào)TLR4信號通路。 第三部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)小膠質細胞TLR4信號，對海馬神經(jīng)元產(chǎn)生保護效應 1.利用離體細胞OGD模型，poly-IC治療降低小膠質細胞分泌的TNF-α、IL-1β的水平，而增IFN-β的水平；免疫熒光結果顯示， poly-IC提高transwell海馬神經(jīng)元生存率；與OGD對照組相比，poly-IC治療組Bcl-2的表達明顯增高，而Bax的表達降低。 2.利用小膠質細胞OGD模型，poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信號分子下調(diào)TLR4通路及NF-κB的活性；Poly-IC治療減少LPS刺激小膠質細胞TNF-α及IL-1β的生成。 3.利用小膠質細胞OGD模型，封閉TLR3信號后，poly-IC下調(diào)TLR4信號及NF-κB活性的效應消失；外源性IFN-β可下調(diào)TLR4信號通路及NF-κB的活性。 第四部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生長期保護作用 1.小鼠MCAO模型，TTC染色及神經(jīng)功能評分顯示，poly-IC減小缺血后14天的腦梗塞體積及改善神經(jīng)功能評分。 2.大鼠腦永久腦缺血模型，與缺血對照組相比，poly-IC治療組腦梗塞體積減小，神經(jīng)功能評分改善。 結論： 1， Poly-IC預處理能減輕局灶性腦缺血再灌注損傷；重要的是，Poly-IC后處理對腦缺血再灌注損傷有治療效應；而且poly-IC治療降低缺血腦組織、腦脊液及外周血中TNF-α及IL-1β的水平，增加IFN-β的水平，提示促炎因子TNF-α及IL-1β的減低和抑炎因子IFN-β的增高在poly-IC腦缺血保護中具有重要作用。 2，Poly-IC治療增加缺血腦組織Bcl-2、Hsp27、Hsp70的水平，降低Bax水平，減少缺血區(qū)變性、凋亡細胞，提示poly-IC腦缺血再灌注損傷的治療效應與其抗凋亡及Hsp27、Hsp70的保護作用有關。 3，Poly-IC治療降低OGD小膠質細胞TNF-α及IL-1β的水平，而增加IFN-β的水平，并且提高海馬神經(jīng)元的生存率，提示poly-IC減輕小膠質細胞炎癥反應，產(chǎn)生海馬神經(jīng)元保護效應。 4，TLR3敲除后，poly-IC腦缺血保護效應消失，提示poly-IC通過TLR3介導腦缺血保護作用。 5，Poly-IC通過TLR3下調(diào)TLR4信號通路，對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護效應。 6，Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷具有長期保護效果應及對大鼠永久性腦缺血損傷產(chǎn)生保護作用。
[Abstract]:......
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【共引文獻】

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