本文關(guān)鍵詞： TOLL樣受體4 聚肌胞酸 缺血再灌注 TOLL樣受體3 TOLL樣受體4信號　出處：《第三軍醫(yī)大學(xué)》2014年博士論文　論文類型：學(xué)位論文

【摘要】：背景與目的：缺血性腦卒中是由腦部血液循環(huán)障礙導(dǎo)致局部神經(jīng)功能缺失為特征的一組疾病，是目前嚴(yán)重威脅人類健康的最主要疾病之一，是當(dāng)今世界最主要致殘和第二大致死疾病。雖歷經(jīng)多年研究，目前有詢證醫(yī)學(xué)證據(jù)支持有效的治療方法是發(fā)病后3-4.5h的靜脈溶栓，但受有限時(shí)間窗及醫(yī)療條件的限制，很少有卒中患者能得到這種治療措施，因此深入研究有效的防治腦卒中的的方法尤為重要，有重要的臨床意義�，F(xiàn)在認(rèn)為腦卒中有效治療方法的匱乏主要原因是卒中的病理生理機(jī)制尚不完全清楚。近年來研究發(fā)現(xiàn)炎癥反應(yīng)在腦缺血繼發(fā)性腦損傷中扮有重要作用。 天然免疫系統(tǒng)是細(xì)菌感染或組織損傷誘導(dǎo)炎癥的主要貢獻(xiàn)者�，F(xiàn)已明確TLRs是天然免疫及PRR家族最重要的模式識別受體之一，主要識別細(xì)胞外的病原微生物和細(xì)胞內(nèi)的吞噬體和溶酶體�，F(xiàn)有明確的證據(jù)表明，TLRs還能識別組織損傷釋放的內(nèi)源性分子，稱之為損傷相關(guān)的分子模式（DAMPs），從而啟動(dòng)TLRs信號通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。TLRs由N端重復(fù)的亮氨酸和Toll/IL-1R的跨膜區(qū)域構(gòu)成。到現(xiàn)在為止，人類已發(fā)現(xiàn)11個(gè)TLRs，而小鼠發(fā)現(xiàn)13個(gè)TLRs，不同的TLRs識別不同的病原微生物分子模式和自身組織分子。比如，TLR2以及它的異源二聚體TLR1/TLR2、TLR6/TLR2識別細(xì)菌和支原體的脂蛋白，TLR3識別病毒雙鏈RNA，TLR4識別革蘭氏陰性細(xì)菌細(xì)胞壁的主要成分脂多糖（LPS）,TLR7識別RNA病毒的單聯(lián)RNA，TLR9識別細(xì)菌或病毒未甲基化的DNA。TLRs表達(dá)在各種不同的免疫細(xì)胞，比如中性粒細(xì)胞、樹狀突細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、B細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞，而且TLRs還表達(dá)在非免疫細(xì)胞上，比如纖維母細(xì)胞、上皮細(xì)胞、角質(zhì)細(xì)胞、心肌細(xì)胞、骨骼肌細(xì)胞以及神經(jīng)元細(xì)胞。TLRs識別病原相關(guān)分子模式或損傷相關(guān)的分子模式，啟動(dòng)TLRs通路，誘導(dǎo)炎癥反應(yīng)。 現(xiàn)已證實(shí)TLRs介導(dǎo)的炎癥反應(yīng)在腦缺血再灌注損傷方面扮有重要的的角色。通過識別缺血損傷神經(jīng)元釋放的DAMPs，激活TLRs受體，誘導(dǎo)NF-κB依賴的促炎細(xì)胞因子和/或干擾素調(diào)節(jié)因子的Ⅰ型干擾素，參與病理生理過程。最近的研究表明，缺血腦組織TLR4mRNA的表達(dá)明顯上調(diào)，而且，腦缺血損傷的神經(jīng)元產(chǎn)生內(nèi)源性配體可以激活TLR4，通過MyD88依賴性信號途徑激活NF-κB轉(zhuǎn)錄，產(chǎn)生促炎因子引起神經(jīng)元的變性、凋亡和壞死。我們和其他實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)，在局灶性MCAO和全腦缺血再灌注損傷模型，TLR4缺陷的小鼠可減小腦梗死體積、減輕腦水腫、降低外周血細(xì)胞因子TNF-α、IL-6的水平以及改善神經(jīng)功能評分。最近的研究顯示，修飾TLRs介導(dǎo)的NF-κB信號通路，可以減輕心臟、腦等器官的缺血再灌注損害。近年來發(fā)現(xiàn)TLR（2，4，7，9）配體的預(yù)處理，可以增加腦組織對再次缺血的耐受，顯著減小腦梗塞體積，減輕神經(jīng)功能缺損。而且，TLR2配體Pam3csk4后處理也能減輕腦缺血再灌注損害。 TLR3受體識別病毒雙鏈RNA，還可以識別poly-IC，雙鏈RNA模擬物。TLR3被激活后募集調(diào)節(jié)蛋白TRIF，激活TRIF依賴的信號通路誘導(dǎo)IFNs和NF-κB的激活。與野生鼠相比，TLR3敲除鼠沒有減小腦缺血再灌注損傷的腦梗死體積，顯示TLR3不直接參與TLRs通路激活導(dǎo)致的炎癥反應(yīng)。近期有報(bào)道TLR3配體poly-IC預(yù)處理對缺血性腦和腎臟再灌注損傷有保護(hù)作用，但TLR3配體poly-IC后處理是否有效及機(jī)制尚不清楚。 已有報(bào)道TLR3配體poly-IC預(yù)處理可以下調(diào)巨噬細(xì)胞TLR4的表達(dá)，抑制LPS誘導(dǎo)的P38-MAPK、PSAPK/JNK信號通路，降低細(xì)胞因子TNF-α的水平，從而減輕LPS誘導(dǎo)的肝損害。因此我們主要推測TLR3配體Poly-IC后處理對腦缺血再灌注損傷的也有保護(hù)作用，其機(jī)制可能通過激活TLR3受體下調(diào)TLR4/MyD88/NF-κB信號通路而產(chǎn)生腦缺血保護(hù)作用。 我們應(yīng)用大腦中動(dòng)脈阻塞（MCAO）小鼠、大鼠模型；離體細(xì)胞培養(yǎng)（OGD）模型，評價(jià)TLR3配體poly-IC后處理對腦缺血再灌注損傷的治療效果及機(jī)制。 方法： 第一部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 1.建立小鼠MCAO模型，，應(yīng)用TTC染色，檢測poly-IC預(yù)處理，特別是后處理對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)效應(yīng)，同時(shí)檢測腦含水量和神經(jīng)功能評分。 2.野生小鼠MCAO48h后，應(yīng)用尼氏染色及透射電鏡，檢測各組海馬神經(jīng)元及線粒體的損傷程度；利用ELISA，檢測缺血腦組織、腦脊液和外周血細(xì)胞因子TNF-α、IL-1β及IFN-β的水平。 3.野生小鼠MCAO48h后，利用Western blot技術(shù)，檢測缺血腦組織的Bcl-2、Bax、Hsp27及Hsp70的表達(dá)；利用免疫熒光技術(shù)，檢測缺血腦組織的TUNEL及FIB陽性細(xì)胞。 第二部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)TLR4信號產(chǎn)生腦缺血保護(hù)效應(yīng) 1. TLR3-/-小鼠MCAO48h后，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，觀察poly-IC后處理對缺血再灌注損傷的效應(yīng)；利用免疫熒光技術(shù)，檢測缺血腦組織的TUNEL及FIB陽性細(xì)胞數(shù)。 2.野生小鼠MCAO48h后，利用Western blot及EMSA技術(shù)，檢測poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信號分子對TLR4通路的影響；利用ELISA技術(shù)，檢測poly-IC治療對LPS刺激小鼠TNF-α及IL-1β水平的影響。 3. TLR4-/-小鼠MCAO48h后，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，觀察poly-IC后處理對缺血再灌注損傷的效應(yīng)。野生小鼠MCAO48h后，利用TTC染色、Western blot及EMSA技術(shù)，檢測腦室注射IFN-β對腦缺血的保護(hù)效應(yīng)及對TLR4信號的影響。 第三部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4信號，對海馬神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng) 1.建立離體細(xì)胞培養(yǎng)糖氧剝離（OGD）模型，利用ELISA技術(shù)，檢測各組小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β及IFN-β的水平；利用免疫熒光技術(shù)，檢測poly-IC對transwell海馬神經(jīng)元生存率的影響；利用Western blot技術(shù)，檢測混合神經(jīng)元-膠質(zhì)細(xì)胞Bcl-2、Bax的表達(dá)。 2.小膠質(zhì)細(xì)胞OGD24h后，利用Western blot及EMSA技術(shù)，檢測poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信號分子對TLR4通路的影響；利用ELISA技術(shù)，檢測poly-IC治療對LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α及IL-1β水平的影響。 3.小膠質(zhì)細(xì)胞OGD24h后，利用Western blot及EMSA技術(shù)，檢測封閉TLR3信號后，TLR4信號通路的變化。而且檢測外源性IFN-β對TLR4通路的影響。 第四部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生長期保護(hù)作用 1.建立小鼠MCAO模型，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，檢測poly-IC的長期腦缺血保護(hù)效應(yīng)。 2.建立大鼠腦永久腦缺血模型，利用TTC染色及神經(jīng)功能評分，檢測poly-IC對大鼠腦缺血的保護(hù)效應(yīng)。 結(jié)果： 第一部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷的保護(hù)作用 1．利用小鼠MCAO模型，poly-IC預(yù)處理能減小腦梗塞體積、減輕腦水腫及改善神經(jīng)功能評分；重要的是，poly-IC后處理對小鼠腦缺血再灌注損害損害有治療效應(yīng)。 2.尼氏染色顯示，缺血再灌注組海馬角1區(qū)和齒狀回區(qū)海馬神經(jīng)元結(jié)構(gòu)嚴(yán)重?fù)p害，主要特征是細(xì)胞體濃縮伴有細(xì)胞核的固縮。然而，poly-IC治療組，海馬神經(jīng)元的損傷明顯減輕。透射電鏡顯示，缺血再灌注組線粒體外膜嚴(yán)重?fù)p害伴有不規(guī)則細(xì)胞器的形成；與此相對照，poly-IC組線粒體顯示基質(zhì)水腫，但線粒體的完整性保持完整。ELISA結(jié)果顯示，與缺血對照組相比，poly-IC后處理組缺血腦組織、腦脊液及外周血細(xì)胞因子TNF-α及IL-1β的水平明顯降低，而IFN-β的水平明顯提高。 3．Western blot結(jié)果顯示，與缺血對照組相比，poly-IC后處理組缺血腦組織Bcl-2、HSP27、HSP70表達(dá)顯著增高，而Bax水平顯著降低；免疫熒光顯示，poly-IC后處理組缺血腦組織的的TUNEL及FJB陽性細(xì)胞明顯減少。 第二部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)TLR4信號產(chǎn)生腦缺血保護(hù)效應(yīng) 1.利用TLR3-/-小鼠MCAO模型，poly-IC的腦缺血的保護(hù)效應(yīng)消失，免疫熒光顯示，與缺血對照組相比，poly-IC后處理組缺血腦組織的的TUNEL及FJB陽性細(xì)胞沒有減少。 2. Western blot及EMSA結(jié)果顯示，poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3通路的信號分子下調(diào)TLR4通路及NF-κB的活性；ELISA結(jié)果顯示，poly-IC治療降低LPS刺激小鼠腦脊液及血液中TNF-α及IL-1β的水平。 3.利用TLR4-/-小鼠MCAO模型，與缺血對照組相比，poly-IC后處理不能進(jìn)一步減輕腦缺血損害。野生小鼠MCAO模型，腦室注射IFN-β能減小腦梗塞體積及下調(diào)TLR4信號通路。 第三部分：Poly-IC通過TLR3下調(diào)小膠質(zhì)細(xì)胞TLR4信號，對海馬神經(jīng)元產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng) 1.利用離體細(xì)胞OGD模型，poly-IC治療降低小膠質(zhì)細(xì)胞分泌的TNF-α、IL-1β的水平，而增IFN-β的水平；免疫熒光結(jié)果顯示， poly-IC提高transwell海馬神經(jīng)元生存率；與OGD對照組相比，poly-IC治療組Bcl-2的表達(dá)明顯增高，而Bax的表達(dá)降低。 2.利用小膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型，poly-IC激活的TLR3/TRIF/IRF3信號分子下調(diào)TLR4通路及NF-κB的活性；Poly-IC治療減少LPS刺激小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α及IL-1β的生成。 3.利用小膠質(zhì)細(xì)胞OGD模型，封閉TLR3信號后，poly-IC下調(diào)TLR4信號及NF-κB活性的效應(yīng)消失；外源性IFN-β可下調(diào)TLR4信號通路及NF-κB的活性。 第四部分：Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生長期保護(hù)作用 1.小鼠MCAO模型，TTC染色及神經(jīng)功能評分顯示，poly-IC減小缺血后14天的腦梗塞體積及改善神經(jīng)功能評分。 2.大鼠腦永久腦缺血模型，與缺血對照組相比，poly-IC治療組腦梗塞體積減小，神經(jīng)功能評分改善。 結(jié)論： 1， Poly-IC預(yù)處理能減輕局灶性腦缺血再灌注損傷；重要的是，Poly-IC后處理對腦缺血再灌注損傷有治療效應(yīng)；而且poly-IC治療降低缺血腦組織、腦脊液及外周血中TNF-α及IL-1β的水平，增加IFN-β的水平，提示促炎因子TNF-α及IL-1β的減低和抑炎因子IFN-β的增高在poly-IC腦缺血保護(hù)中具有重要作用。 2，Poly-IC治療增加缺血腦組織Bcl-2、Hsp27、Hsp70的水平，降低Bax水平，減少缺血區(qū)變性、凋亡細(xì)胞，提示poly-IC腦缺血再灌注損傷的治療效應(yīng)與其抗凋亡及Hsp27、Hsp70的保護(hù)作用有關(guān)。 3，Poly-IC治療降低OGD小膠質(zhì)細(xì)胞TNF-α及IL-1β的水平，而增加IFN-β的水平，并且提高海馬神經(jīng)元的生存率，提示poly-IC減輕小膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)，產(chǎn)生海馬神經(jīng)元保護(hù)效應(yīng)。 4，TLR3敲除后，poly-IC腦缺血保護(hù)效應(yīng)消失，提示poly-IC通過TLR3介導(dǎo)腦缺血保護(hù)作用。 5，Poly-IC通過TLR3下調(diào)TLR4信號通路，對腦缺血再灌注損傷產(chǎn)生保護(hù)效應(yīng)。 6，Poly-IC對小鼠腦缺血再灌注損傷具有長期保護(hù)效果應(yīng)及對大鼠永久性腦缺血損傷產(chǎn)生保護(hù)作用。
[Abstract]:......
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R743.3

【共引文獻(xiàn)】

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