本文關鍵詞： 核相關因子2 Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關蛋白1 曲古抑菌素A 重組質(zhì)粒 蛋白酶體途徑 溶酶體途徑　出處：《南京大學》2014年碩士論文　論文類型：學位論文

【摘要】：研究背景：細胞防御的一個重要機制就是Keap1-Nrf2信號通路的激活。生理狀態(tài)下,Keap1 (Kelch-like ECH-associated proteinl)作為Cul3依賴性E3 (ubiquitin-protein ligase)泛素連接酶復合物的銜接蛋白,介導轉(zhuǎn)錄因子Nrf2 (NF-E2-related factor 2)泛素化,被26S蛋白酶體降解。在應激或傷害條件下,Nr-2與Keap1解偶聯(lián)并轉(zhuǎn)入細胞核內(nèi),調(diào)節(jié)其下游靶基因表達。因此,胞質(zhì)蛋白Keap1對于Nrf2的激活具有重要意義。催化蛋白去乙�；慕M蛋白去乙�；�(histone deacetylases, HDAC)被認為可能是治療許多人類疾病的有用靶點,包括中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。研究表明,HDAC抑制劑能夠通過激活lKeap1-Nrf2通路,發(fā)揮神經(jīng)保護作用,但是對其激活機制目前尚未完全闡明。本研究旨在探討在RAW 264.7細胞中,HDAC抑制劑TSA調(diào)控Keap1-Nrf2信號通路的可能作用機制。研究目的：1、確認TSA可以激活Keap1-Nrf2通路；2、構建真核重組質(zhì)粒pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-624), pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(1-314)和pcDNA3.1-6cmyc-Keap1(315-624),研究TSA作用于Keap1的可能功能片段；3、研究TSA是否能夠通過蛋白水平調(diào)控Keap1。若能,則進一步探討TSA促進Keap1蛋白降解的可能途徑。研究方法：1、培養(yǎng)RAW 264.7細胞,利用不同濃度的TSA(10ng/ml,30ng/ml, 100ng/ml)處理細胞16h, Western Blot法檢鋇Keap1、 Nrf2、 HO1和NQO1蛋白表達水平；RT-PCR法檢鋇Keap1 mRNA表達水平；2、培養(yǎng)RAW 264.7細胞,利用一定濃度的TSA(30ng/ml)處理細胞4h,免疫熒光法檢測Nrf2的核易位情況。3、利用限制性內(nèi)切酶和DNA測序?qū)嫿ǖ闹亟M質(zhì)粒進行鑒定；4、培養(yǎng)RAw 264.7細胞,TSA(30ng/ml)和ActD(0.5ug/ml)共處理細胞12h, Western Blot檢測]Keap1蛋白表達情況,RT-PCR檢鋇Keapl mRNA表達情況；5.Lipo 2000轉(zhuǎn)染RAW264.7細胞,TSA (30ng/ml)處理16h,收集轉(zhuǎn)染48h的蛋白,外源性Keap1蛋白表達水平利用Western Blot法檢測；6、培養(yǎng)RAW 264.7細胞,TSA (30ng/ml)和MG-132(5umol/L)/3-MA (5mmol/L)共處理細胞12h,免疫印跡法檢鋇Keap1蛋白表達水平。研究結果：1、TSA抑制內(nèi)源性Keap1蛋白和mRNA表達水平,且這種抑制作用具有劑量和時間依賴性；2、TSA促-Nrf2核易位,同時上調(diào)其下游蛋白表達；3、重組質(zhì)粒經(jīng)過酶切鑒定和DNA序列比對,證實構建成功；4、TSA和ActD共處理后,Keap1蛋白表達明顯減少,而Keap1 mRNA水平無明顯變化；5、TSA促進外源性Keap1蛋白降解；6、蛋白酶抑制劑MG-132和自噬抑制劑3-MA不影響TSA對Keap1蛋白的降解。結論：HDAC抑制劑TSA能夠抑制Keap1表達,激活Nrt2,引發(fā)下游反應。TSA不僅可以通過轉(zhuǎn)錄水平抑制Keap1表達,還能從蛋白水平抑制其表達,即TSA可以直接促進Keap1蛋白降解,而導致Keap1蛋白降解的途徑有可能不依賴蛋白酶體途徑和溶酶體途徑,詳細機制仍有待進一步研究。
[Abstract]:Background: one of the important mechanisms of cell defense is the activation of Keap1-Nrf2 signaling pathway. Keap1 Kelch-like ECH-associated protein 1 as a Cul3 dependency E _ 3 (. Ubiquitin-protein ligase) the binding protein of the ubiquitin ligase complex. The transcriptional factor Nrf2 / NF-E2-related factor 2) is ubiquitized and degraded by 26s proteasome under stress or injury conditions. Nr-2 is uncoupled with Keap1 and transferred into the nucleus to regulate its downstream target gene expression. Cytoplasmic protein Keap1 plays an important role in the activation of Nrf2. Histone deacetylases catalyzes the deacetylation of proteins. HDAC) may be a useful target for the treatment of many human diseases, including central nervous system diseases. Studies have shown that HDACs inhibitors can activate the lKeap1-Nrf2 pathway. This study was designed to explore the role of neuroprotective effect in RAW 264.7 cells, but the mechanism of its activation has not been fully elucidated. The possible mechanism of Keap1-Nrf2 signaling pathway regulated by HDAC inhibitor TSA. Objective: to confirm that TSA can activate Keap1-Nrf2 pathway; 2.Eukaryotic recombinant plasmid pcDNA3.1-6cmyc-Keap11-624) was constructed. PcDNA3.1-6cmyc-Keap1 (1-314) and pcDNA3.1-6cmyc-Keap1 (315-624). The possible functional fragments of TSA acting on Keap1 were studied. 3. To study whether TSA can regulate Keap1 through protein level, and if so, to further explore the possible pathway of TSA promoting Keap1 protein degradation. RAW 264.7 cells were cultured and treated with different concentrations of TSA 10 ng / ml 30 ng / ml, 100 ng / ml for 16 h. The expression levels of barium Keap1, Nrf2, HO1 and NQO1 protein were detected by Western Blot method. The expression of barium Keap1 mRNA was detected by RT-PCR method. 2. RAW 264.7 cells were cultured and treated with a certain concentration of TSA 30 ng / ml for 4 h. The nuclear translocation of Nrf2 was detected by immunofluorescence method. The recombinant plasmid was identified by restriction endonuclease and DNA sequencing. (4) RAw 264.7 cells were co-treated with TSA 30 ng / ml and ActDX 0.5 g / ml for 12 h. The expression of Keap1 protein was detected by Western Blot. The expression of barium Keapl mRNA was detected by RT-PCR. 5. The RAW264.7 cells were transfected with Lipo 2000 for 16 h and the protein was collected after transfection for 48 h. The expression of exogenous Keap1 protein was detected by Western Blot. 6. The cells were co-treated with RAW 264.7 cells at 30 ng / ml and 5 mmol / L MG-132(5umol/L)/3-MA for 12 h. The expression of barium Keap1 protein was detected by Western blotting. Results the expression of endogenous Keap1 protein and mRNA was inhibited by 1: 1 TSA in a dose-and time-dependent manner. 2TSA promoted the nuclear translocation of -Nrf2 and up-regulated its downstream protein expression. 3. The recombinant plasmid was successfully constructed by restriction endonuclease digestion and DNA sequence alignment. 4After co-treatment of TSA and ActD, the expression of Keap1 protein decreased significantly, but the level of Keap1 mRNA did not change significantly. 5TSA promoted the degradation of exogenous Keap1 protein; 6. Protease inhibitor MG-132 and autophagy inhibitor 3-MA did not affect the degradation of Keap1 protein by TSA. Conclusion TSA can inhibit the expression of Keap1. Activation of Nrt2, initiation of downstream reaction. TSA can not only inhibit the expression of Keap1 through transcription level, but also inhibit its expression from the protein level, that is, TSA can directly promote the degradation of Keap1 protein. However, the pathway leading to the degradation of Keap1 protein may not depend on the proteasome pathway and lysosomal pathway, and the detailed mechanism remains to be further studied.
【學位授予單位】：南京大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R741

【相似文獻】

相關期刊論文 前10條

1 徐琛蓉;章錦才;趙川江;張?zhí)N惠;;重組質(zhì)粒PcDNA3.1/sTNFRⅠ在小鼠體內(nèi)表達的初步研究[J];實用口腔醫(yī)學雜志;2006年02期

2 成桂明;楊慧蘭;;pGEX-4T-1/HSV2-gG重組質(zhì)粒的構建及表達[J];中國現(xiàn)代醫(yī)學雜志;2009年09期

3 王斌;質(zhì)粒DNA的構型變化對轉(zhuǎn)錄的調(diào)控作用[J];遺傳學報;1987年01期

4 張秀華;;重組質(zhì)粒的穩(wěn)定性[J];國外醫(yī)藥(抗生素分冊);1991年03期

5 陳飛,吳紅艷,劉艷玲,李莉;蚯蚓溶栓酶重組質(zhì)粒遺傳穩(wěn)定性的研究[J];中醫(yī)藥學刊;2002年06期

6 馬大偉;陳桂生;杜彥輝;;pGBKT7-hSOD1cDNA重組質(zhì)粒的構建及鑒定[J];寧夏醫(yī)學雜志;2011年06期

7 齊義鵬,黃永秀;昆蟲病毒重組質(zhì)粒的快速提取[J];病毒學報;1987年02期

8 徐迎佳,何奔,沈南,王彬堯,鄭道聲;人白介素-1β轉(zhuǎn)換酶的克隆及重組質(zhì)粒構建[J];上海第二醫(yī)科大學學報;1999年01期

9 孫念峰;孟慶義;田愛玲;王瑞華;劉兆軒;李博;;重組質(zhì)粒pDsRed1-C1-TRAIL的構建及鑒定[J];中國現(xiàn)代普通外科進展;2010年11期

10 方瀟碧;張春鴻;黃亞;林森;黃振校;吳麗萍;施清圓;李文峰;廖志蘇;;重組質(zhì)粒pENTR-CMV-EGFP-hsa-mir-16-1/15a的構建與表達[J];實用醫(yī)學雜志;2011年12期

相關會議論文 前10條

1 余勝兵;馮艾榮;周平;胡繼明;;一種新的毛細管電泳動態(tài)涂層介質(zhì)在質(zhì)粒DNA分離中的應用[A];中國化學會第十三屆有機分析與生物分析學術會議論文集[C];2005年

2 李夢南;任大明;王磊;肖偉;鄭廣宏;;重組質(zhì)粒DNA在熱處理過程中的降解/變性規(guī)律研究[A];上海市化學化工學會2007年度學術年會論文摘要集[C];2007年

3 李迪;谷鴻喜;張鳳民;鐘照華;程志;;pQE32-HPV18 L1重組質(zhì)粒的構建及鑒定[A];慶祝黑龍江省免疫學會成立十周年（1993—2003）論文集[C];2003年

4 劉茂軍;張映;邵國青;聶向庭;;重組質(zhì)粒的構建、表達及活性鑒定[A];動物生理生化學分會第八次學術會議暨全國反芻動物營養(yǎng)生理生化第三次學術研討會論文摘要匯編[C];2004年

5 寧興旺;謝小兵;朱惠斌;王述湘;葛金文;;α-烯醇化酶重組質(zhì)粒的構建及其表達形式的研究[A];第一次全國中西醫(yī)結合檢驗醫(yī)學學術會議暨中國中西醫(yī)結合學會檢驗醫(yī)學專業(yè)委員會成立大會論文匯編[C];2014年

6 趙燕;童富淡;;家蠶HMGA(BmHMGA)表達及功能初步研究[A];華東六省一市生物化學與分子生物學會2009年學術交流會論文摘要匯編[C];2009年

7 徐麗;彭景ii;;重組質(zhì)粒pCR3.1-brZPC'的表達及其抗生育作用[A];第九次全國生殖生物學學術研討會論文摘要集[C];2003年

8 周珊;徐修禮;馬越云;劉家云;孫怡群;郝曉柯;;HBHA蛋白在結核病診斷中應用研究[A];中華醫(yī)學會第九次全國檢驗醫(yī)學學術會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗實驗室管理學術會議論文匯編[C];2011年

9 章軍;秦燕;徐虹;陳天圣;樓士林;;利用穿梭表達重組質(zhì)粒在藍藻Synechococcus sp.PCC7942中表達胸腺素α_1[A];中國藻類學會第十一次學術討論會論文摘要集[C];2001年

10 高方友;楊輝;張治元;何家全;劉仕勇;邱克軍;;重組質(zhì)粒pEGFP-mD1x5的構建及其在室管膜前下區(qū)神經(jīng)干細胞中的表達研究[A];貴州省醫(yī)學會神經(jīng)外科學分會第七屆學術交流會暨神經(jīng)外科學新進展學習班論文集[C];2006年

相關重要報紙文章 前1條

1 記者　耿建擴 藺玉堂;“表達凝血八因子新的重組質(zhì)�！背晒ρ兄芠N];光明日報;2006年

相關博士學位論文 前4條

1 張泉;重組質(zhì)粒DNA的規(guī)�；a(chǎn)工藝及質(zhì)量鑒定研究[D];揚州大學;2006年

2 朱鴻飛;重組質(zhì)粒pcDNAKCpG生物安全性研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學院;2005年

3 崔福愛;BMP-6和VEGF表達載體的構建及其促進成骨作用的實驗研究[D];山東大學;2010年

4 王席娟;SP-B-C/A(-18)基因多態(tài)性與高氧肺損傷易感性關系研究[D];華中科技大學;2013年

相關碩士學位論文 前10條

1 汪小五;肺炎支原體P1-C末端特異性抗原蛋白的制備及其基因分型的研究[D];安徽醫(yī)科大學;2015年

2 劉加美;組蛋白去乙�；敢种苿㏕SA調(diào)控Keap1-Nrf2信號通路的相關機制研究[D];南京大學;2014年

3 李夢南;熱處理廢棄重組質(zhì)粒DNA的有效性與安全性分析[D];同濟大學;2008年

4 李茜;pcDNA3.1-preS1-GFP重組質(zhì)粒的構建及其在小鼠精子內(nèi)的表達[D];青島大學;2010年

5 張戰(zhàn)鋒;細胞周期依賴性蛋白激酶2重組質(zhì)粒的構建與表達[D];廣州中醫(yī)藥大學;2011年

6 黃麗春;酵母代謝木糖產(chǎn)乙醇重組質(zhì)粒的構建[D];廈門大學;2009年

7 劉陽;剛地弓形蟲HSP70基因重組質(zhì)粒的構建及其誘導小鼠的細胞免疫應答[D];山西醫(yī)科大學;2011年

8 楊媚娜;β轉(zhuǎn)化生長因子受體Ⅱ啟動子熒光素酶報告基因重組質(zhì)粒的構建[D];吉林大學;2012年

9 馬大偉;pGBKT7-hSOD1cDNA重組質(zhì)粒的構建和序列分析[D];寧夏醫(yī)科大學;2011年

10 劉玲娟;DNA甲基轉(zhuǎn)移酶1在同型半胱氨酸致人臍靜脈平滑肌細胞增殖中的作用研究[D];寧夏醫(yī)科大學;2011年

，

本文編號：1455983