本文關(guān)鍵詞：HCMV感染對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87自噬的影響及意義　出處：《青島大學(xué)》2015年碩士論文　論文類型：學(xué)位論文

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【摘要】：目的:1.人巨細(xì)胞病毒(human cytomegalovirus,HCMV)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87,通過(guò)觀察自噬體形態(tài)及數(shù)量的變化、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3(LC3)表達(dá)水平的變化,從而研究HCMV感染對(duì)U87細(xì)胞自噬水平所產(chǎn)生的影響。2.HCMV感染U87后,檢測(cè)自噬相關(guān)基因Beclin1及其蛋白的表達(dá)量,并檢測(cè)細(xì)胞活性,從而探討HCMV感染在神經(jīng)膠質(zhì)瘤在發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中起到的作用及意義。方法與材料:1.HCMV AD169(MOI=5)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87后,通過(guò)相差顯微鏡觀察病毒感染6h、12h、24h、48h后的形態(tài)學(xué)改變。2.在HCMV AD169(MOI=5)病毒感染U87細(xì)胞6h、48h后,用透射電鏡觀察自噬小體的數(shù)目及形態(tài)。用HCMV AD169(MOI=5)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞6h、12h、24h、48h;并在各對(duì)應(yīng)時(shí)間點(diǎn)用未感染的細(xì)胞作對(duì)照組。收集細(xì)胞并用Western-blot和免疫熒光對(duì)LC3編碼蛋白表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)。3.用HCMV AD169(MOI=5)感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞,分別在6h、12h、24h、48h后收集細(xì)胞;同時(shí)將未感染的細(xì)胞作為對(duì)照。用RT-PCR檢測(cè)基因Beclin1的表達(dá);并用Western-blot和免疫熒光對(duì)Beclin1蛋白進(jìn)行檢測(cè)。4.CCK-8法對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖活性的情況進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果:1.HCMV感染U87細(xì)胞6h、12h、24h、48h后,細(xì)胞形態(tài)明顯發(fā)生變化。2.在電鏡下觀察HCMV感染U87細(xì)胞6h、48h后的自噬小體數(shù)目及形態(tài)。結(jié)果顯示,相比較6h的自噬體數(shù)目,在48h時(shí)自噬體數(shù)量明顯減少;并于6h、8h時(shí)在鏡下分別觀察到初始自噬小體(Initial autophagic vacuole,AVi)和晚期自噬小體(Late/Degradative autophagic vacuole,AVd),自噬小體均具膜結(jié)構(gòu),且在胞漿內(nèi)可觀察到未完全降解或者已降解的細(xì)胞器等。Western-blot結(jié)果顯示,HCMV感染U87細(xì)胞6 h、12h、24 h、48 h后,LC3-II相對(duì)表達(dá)水平逐漸下降(P0.05);LC3-II/I相對(duì)表達(dá)量也呈下調(diào)趨勢(shì)(P0.01)。而未感染組LC3-II、LC3-II/I蛋白相對(duì)表達(dá)量未有明顯變化(P0.05)。其結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致,均證實(shí)LC3蛋白表達(dá)水平明顯減少。3.PCR檢測(cè)結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,感染組Beclin1m RNA相對(duì)表達(dá)量逐漸減少(P㩳0.01)。Western-blot結(jié)果顯示,與未感染組相比,HCMV感染U87細(xì)胞6 h、12h、24 h、48 h,Beclin1相對(duì)表達(dá)量逐漸下降(P0.05)。其結(jié)果與免疫熒光結(jié)果一致,證實(shí)Beclin1表達(dá)水平明顯減少。4.CCK-8結(jié)果顯示,HCMV感染U87細(xì)胞6 h、12h、24 h、48 h后,細(xì)胞活性逐漸增高(P㩳0.01)。結(jié)論:1.HCMV感染膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞后,自噬受到抑制。2.HCMV感染神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞導(dǎo)致Beclin1基因及蛋白表達(dá)量下降,且細(xì)胞活性逐漸增強(qiáng),即HCMV誘導(dǎo)膠質(zhì)瘤細(xì)胞U87的增殖可能受Beclin1蛋白的調(diào)控。
[Abstract]:Objective to observe the morphology and quantity of autophagy in human cytomegalovirus (HCMV) infected glioma cell line U87. The change of microtubule-associated protein 1 light chain 3LC3) expression, so as to study the effect of HCMV infection on the autophagy level of U87 cells. 2. HCMV infection with U87. To detect the expression of autophagy related gene Beclin1 and its protein, and to detect the cell activity, HCMV infection was detected in glioma. Methods: 1. HCMV AD169 and MOI5) were infected with U87 glioma cells, and the virus infection was observed by phase contrast microscope for 6 h. The morphological changes of U87 cells were observed at 12h, 24h and 48h, respectively. 2. After HCMV AD169 moi 5) virus was infected with U87 cells for 6 h and 48 h later. The number and morphology of autophagy bodies were observed by transmission electron microscope. U87 cells were infected with HCMV AD169 moi 5 for 24 h or 48 h. The uninfected cells were used as control group at each corresponding time point. Western-blot and immunofluorescence were used to detect the expression level of LC3 coding protein. 3. HCMV was used to detect the expression of LC3 protein. AD169 (. The glioma U87 cells were infected with MOI5. The cells were collected at 6h ~ 12h ~ 24h ~ (th) after 48 h. At the same time, uninfected cells were used as control. RT-PCR was used to detect the expression of Beclin1. Beclin1 protein was detected by Western-blot and immunofluorescence. 4. The proliferative activity of glioma cell U87 was detected by CCK-8 method. Results:. 1. HCMV was infected with U87 cells for 6 h. The morphology of U87 cells was observed under electron microscope. The number and morphology of autophagy were observed under electron microscope after HCMV infection for 6 h or 48 h. Compared with the number of autophagy at 6 h, the number of autophagy decreased significantly at 48 h. Initial autophagic vacuole was observed under microscope at 6 h or 8 h. Aviv) and late stage autophagic autophagic Vacuoleus. The autophagy has membrane structure. Western-blot results showed that HCMV infected U87 cells for 6 h and 12 h for 24 h. 48 h later, the relative expression level of LC3-II decreased gradually. The relative expression of LC3-II/I was also down-regulated (P 0.01), while LC3-II was not infected. There was no significant change in the relative expression of LC3-II/I protein. The results were consistent with those of immunofluorescence. All of them confirmed that the expression of LC3 protein was significantly decreased. 3. The results showed that the relative expression of Beclin1m RNA in infected group was gradually decreased compared with the control group. 3. Compared with the control group, HCMV was infected with U87 cells for 6 h, 12 h and 24 h and 48 h, respectively. The relative expression of Beclin1 decreased gradually, and the results were consistent with the results of immunofluorescence, which confirmed that the level of Beclin1 expression was significantly decreased. 4. The results of CCK-8 showed that. The cell activity of U87 cells increased gradually after HCMV infection for 24 h or 48 h after infection with U87 cells for 6 h or 12 h. Conclusion 1. HCMV infected U87 glioma cells. Inhibition of autophagy. 2. HCMV-infected glioma U87 cells decreased the expression of Beclin1 gene and protein, and the cell activity increased gradually. That is, the proliferation of U87 cells induced by HCMV may be regulated by Beclin1 protein.
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.41

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