發(fā)布時間：2017-12-20 23:06

  本文關鍵詞：EGCG對實驗性蛛網(wǎng)膜下腔出血后線粒體質(zhì)量調(diào)控的分子機制研究　出處：《新鄉(xiāng)醫(yī)學院》2015年碩士論文　論文類型：學位論文

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【摘要】：背景蛛網(wǎng)膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)最常見病因為動脈瘤破裂和腦血管畸形,具有高致死率、高致殘率等特點。在諸如阿爾茨海默病(Alzheimer's disease, AD)、帕金森病(Parkinson's disease, PD)和肌萎縮側(cè)索硬化(Amyotrophic lateral sclerosis, ALS)等神經(jīng)退行性疾病中,受損線粒體的質(zhì)量調(diào)控影響神經(jīng)元的存活。表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin gallate, EGCG)是綠茶多酚的主要成分,其在癌癥、炎性疾病、心血管疾病以及神經(jīng)退行性疾病中的保護作用日益受到關注。本研究選擇具有交感神經(jīng)元特性的PCI2細胞建立體外SAH模型,旨在觀察,EGCG對SAH后交感神經(jīng)元線粒體損傷是否有保護作用,并從線粒體質(zhì)量調(diào)控的角度探討EGCG的作用機制。方法1.制備PCI2細胞SAH模型,用MTT法篩選出EGCG的最佳保護濃度(50μmol/L)。2.選對數(shù)生長期的細胞隨機分為3組：1：對照組；2：SAH模型組；3：EGCG 50μmol/L保護組。應用線粒體膜電位和活性氧檢測試劑盒,檢測EGCG對SAH細胞模型的線粒體保護作用。3.應用qRT-PCR方法檢測線粒體質(zhì)量調(diào)控：線粒體分裂和融合基因FIS1、 MFN1、OPA1及PINK1、PARKIN的表達。4.應用透射電鏡觀察EGCG對SAH細胞模型自噬的影響；應用qRT-PCR法檢測自噬相關基因ATG5、BECLIN1、LC3-Ⅱ等的表達。結(jié)果1.EGCG預適應后維持神經(jīng)細胞正常生長。SAH組細胞活力明顯升高,與對照組相比具有顯著的統(tǒng)計學意義(P0.01)：不同濃度的EGCG預處理后,EGCG呈劑量依賴方式抑制SAH后細胞增殖,與SAH組相比,1μmol/L組具有統(tǒng)計學意義(P0.05),5、10、25、50 μmol/L組具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。2. EGCG保護SAH后線粒體功能。熒光顯微鏡觀察線粒體膜電位的變化發(fā)現(xiàn),正常組細胞以紅色熒光為主,SAH后細胞內(nèi)紅色熒光減少,綠色熒光增多,提示線粒體膜電位在SAH后發(fā)生了去極化。EGCG預適應后細胞內(nèi)熒光恢復到了以紅色為主、綠色減少的形式,提示EGCG維持了SAH后線粒體膜電位的正常狀態(tài)。熒光顯微鏡下,正常組細胞內(nèi)可見紅色熒光,SAH組較正常組紅色熒光明顯減少,EGCG組細胞內(nèi)紅色熒光量較SAH組明顯增加,接近于正常對照組。定量分析顯示,線粒體膜電位去極化在SAH組變化明顯,與空白對照組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)；以50μmol/L EGCG預處理后,與SAH組相比,線粒體膜電位升高顯著(P0.01),與正常細胞組相比,具有顯著統(tǒng)計學意義(P0.01)。ROS主要由細胞內(nèi)線粒體產(chǎn)生,以熒光顯微鏡觀察ROS在細胞內(nèi)的含量變化顯示,SAH后ROS熒光增加,EGCG可拮抗這一變化。定量分析顯示,ROS在SAH組顯著性升高(P0.01),EGCG預處理后,活性氧水平較SAH組明顯降低(P0.01),較正常細胞組有顯著性意義(P0.01)。3. EGCG對線粒體質(zhì)量調(diào)控的作用：qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn),SAH組線粒體分裂和融合基因FIS1、MFN1、OPA1基因表達量較正常組升高,FIS1表達較正常組具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；EGCG組FIS1、MFN1、OPA1基因表達較SAH組降低。PINK1和PARKIN基因在SAH組表達增加,PARKIN與空白對照組相比有顯著統(tǒng)計學差異(P0.01)；EGCG組PINK1 表達量降低,較正常對照組和SAH組均具有統(tǒng)計學意義(P0.01)；PARKIN表達量較SAH無明顯變化,較正常對照組有統(tǒng)計學意義(P0.01)。4. EGCG對細胞自噬的影響：透射電鏡發(fā)現(xiàn),SAH組和EGCG組均可見較多的自噬小體形成,自噬體內(nèi)可見雙層膜結(jié)構(gòu)的線粒體存在,EGCG預處理組自噬小體數(shù)量較SAH組減少。qRT-PCR法檢測發(fā)現(xiàn),與正常組相比,SAH組BECLIN1、 LC3-Ⅱ基因mRNA表達量增加,但ATG5基因表達量降低；EGCG預處理后,自噬相關基因表達均降低(P0.05)結(jié)論EGCG通過線粒體質(zhì)量調(diào)控機制,依賴自噬途徑發(fā)揮SAH后的線粒體保護作用。
【學位授予單位】：新鄉(xiāng)醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.34

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本文編號：1313734