本文關(guān)鍵詞：TRIF信號(hào)在原代星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子釋放中的作用及機(jī)制

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【摘要】：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,星形膠質(zhì)細(xì)胞(Astrocyte,AS)是分布最廣泛的細(xì)胞,而且是數(shù)量最多的細(xì)胞,它具有復(fù)雜多樣的結(jié)構(gòu)與功能,在分泌營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境等方面均發(fā)揮了重要功能[1,2],參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病情發(fā)生和病理過(guò)程。近年來(lái)的研究表明,星形膠質(zhì)細(xì)胞也具有免疫功能,星形膠質(zhì)細(xì)胞在腦內(nèi)調(diào)節(jié)免疫功能則主要是通過(guò)產(chǎn)生炎癥細(xì)胞因子來(lái)發(fā)揮重要的作用[3]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一類非常重要蛋白質(zhì)分子,它參與了非特異性免疫(天然免疫)的反應(yīng),也是連接著非特異性免疫以及特異性免疫的樞紐。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),TLRs主要存在并表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中[4.5],但是在星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)。星形膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥方面的效應(yīng)可能與TLRs有關(guān)。目的:本實(shí)驗(yàn)研究在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞中,通過(guò)誘導(dǎo)刺激使星形膠質(zhì)細(xì)胞活化,觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥因子分泌的不同變化,并觀察這種變化與TRIF信號(hào)通路的聯(lián)系,進(jìn)而探討TRIF信號(hào)通路對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥反應(yīng)的影響。方法:1.原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的培養(yǎng):使用新生1-2天的C57乳鼠,取大腦皮層制備原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,傳代3次,星形膠質(zhì)細(xì)胞傳代時(shí)取少量細(xì)胞種植于24孔板內(nèi)玻片上,24 h后,待細(xì)胞完全貼壁時(shí)使用多聚甲醛固定,進(jìn)行兔抗GFAP多克隆抗體的免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定培養(yǎng)細(xì)胞,同時(shí)利用CD11b抗體檢測(cè)小膠質(zhì)細(xì)胞,并用TRIF以及TLR3抗體進(jìn)行檢測(cè)觀察。星形膠質(zhì)細(xì)胞純度計(jì)數(shù)高于95%時(shí)用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.實(shí)驗(yàn)分為四組:(1)對(duì)照組:常規(guī)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,不經(jīng)過(guò)任何處理;(2)LPS處理組:用脂多糖(LPS)(100ng/ml)處理細(xì)胞24小時(shí),利用熒光定量PCR觀察iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達(dá)變化;(3)IL-4處理組:用白細(xì)胞介素-4(IL-4)(20ng/ml)處理細(xì)胞24小時(shí),利用熒光定量PCR觀察ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、TNF-α、IL-6的mRNA表達(dá)變化;(4)Poly(I:C)處理組:用Poly(I:C)(25μg/ml)處理細(xì)胞24小時(shí),利用熒光定量PCR觀察IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β、ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、CD68的mRNA表達(dá)變化。3.敲降TRIF后炎癥因子的表達(dá):利用siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,獲得TRIF表達(dá)量特異性下降的星形膠質(zhì)細(xì)胞,分別用LPS、IL-4處理敲降TRIF以及未敲降TRIF的星形膠質(zhì)細(xì)胞。比較敲降TRIF前后所分泌的炎癥因子mRNA水平表達(dá)的變化。結(jié)果:1.免疫組化結(jié)果顯示,經(jīng)過(guò)3次傳代后,GFAP陽(yáng)性標(biāo)記的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞純度計(jì)數(shù)可達(dá)95%,CD11b檢測(cè)基本未見(jiàn)陽(yáng)性標(biāo)記,可排除小膠質(zhì)細(xì)胞的影響。TRIF以及TLR3抗體檢測(cè),部分細(xì)胞標(biāo)記陽(yáng)性。2.Q-PCR結(jié)果顯示,利用LPS處理后,炎癥促進(jìn)因子IL-6、iNOS、TNF-α等mRNA表達(dá)上升。用IL-4刺激后,炎癥抑制因子ARG1、CD206、IL-10等mRNA表達(dá)上升;促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)下降。用Poly(I:C)刺激后,促炎因子IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表達(dá)以及抑炎因子ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、CD68的mRNA表達(dá)均升高。3.Q-PCR結(jié)果表明,siRNA轉(zhuǎn)染敲降TRIF原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,在IL-4的刺激下,可見(jiàn)Arg1和CD206的mRNA表達(dá)在敲除TRIF之后明顯下調(diào),TNF-α和IL-6的mRNA表達(dá)在敲除之后(siTRIF+IL-4組)較siNC+IL-4組則上升;在siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞24小時(shí)后,利用LPS刺激,IL-6、TNF-α、iNOS、IL-1β的表達(dá)在敲除之后的LPS處理組(siTRIF+LPS組)較siNC+LPS組都明顯下降。主要結(jié)論:1.用出生1-2天的C57乳鼠,經(jīng)過(guò)3次傳代,能培養(yǎng)出純度高于95%的原代星形膠質(zhì)細(xì)胞,可排除小膠質(zhì)細(xì)胞的影響,且TLR3以及TRIF在星形膠質(zhì)細(xì)胞中也有表達(dá)。2.利用LPS、IL4、Poly(I:C)刺激原代星形膠質(zhì)細(xì)胞后,各種炎癥因子的mRNA表達(dá)變化均有明顯變化,證實(shí)原代星形膠質(zhì)細(xì)胞可被LPS、IL4、Poly(I:C)等誘導(dǎo)而活化。3.敲降原代星形膠質(zhì)細(xì)胞的TRIF后,再分別用IL4和LPS刺激,各炎癥因子的mRNA變化可有明顯的升高或者降低,證實(shí)TRIF信號(hào)通路在星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化過(guò)程中起重要作用。
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741

【參考文獻(xiàn)】

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