本文關(guān)鍵詞：TRIF信號在原代星形膠質(zhì)細胞炎癥因子釋放中的作用及機制

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【摘要】：在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中,星形膠質(zhì)細胞(Astrocyte,AS)是分布最廣泛的細胞,而且是數(shù)量最多的細胞,它具有復雜多樣的結(jié)構(gòu)與功能,在分泌營養(yǎng)物質(zhì)、調(diào)節(jié)神經(jīng)元微環(huán)境等方面均發(fā)揮了重要功能[1,2],參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)退行性疾病的病情發(fā)生和病理過程。近年來的研究表明,星形膠質(zhì)細胞也具有免疫功能,星形膠質(zhì)細胞在腦內(nèi)調(diào)節(jié)免疫功能則主要是通過產(chǎn)生炎癥細胞因子來發(fā)揮重要的作用[3]。Toll樣受體(Toll-like receptors,TLR)是一類非常重要蛋白質(zhì)分子,它參與了非特異性免疫(天然免疫)的反應,也是連接著非特異性免疫以及特異性免疫的樞紐。在中樞神經(jīng)系統(tǒng),TLRs主要存在并表達于小膠質(zhì)細胞和巨噬細胞中[4.5],但是在星形膠質(zhì)細胞中也有表達。星形膠質(zhì)細胞在炎癥方面的效應可能與TLRs有關(guān)。目的:本實驗研究在原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞中,通過誘導刺激使星形膠質(zhì)細胞活化,觀察星形膠質(zhì)細胞炎癥因子分泌的不同變化,并觀察這種變化與TRIF信號通路的聯(lián)系,進而探討TRIF信號通路對星形膠質(zhì)細胞炎癥反應的影響。方法:1.原代星形膠質(zhì)細胞的培養(yǎng):使用新生1-2天的C57乳鼠,取大腦皮層制備原代星形膠質(zhì)細胞,傳代3次,星形膠質(zhì)細胞傳代時取少量細胞種植于24孔板內(nèi)玻片上,24 h后,待細胞完全貼壁時使用多聚甲醛固定,進行兔抗GFAP多克隆抗體的免疫細胞化學鑒定培養(yǎng)細胞,同時利用CD11b抗體檢測小膠質(zhì)細胞,并用TRIF以及TLR3抗體進行檢測觀察。星形膠質(zhì)細胞純度計數(shù)高于95%時用于后續(xù)實驗。2.實驗分為四組:(1)對照組:常規(guī)培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞,不經(jīng)過任何處理;(2)LPS處理組:用脂多糖(LPS)(100ng/ml)處理細胞24小時,利用熒光定量PCR觀察iNOS、TNF-α、IL-6、IL-1β的表達變化;(3)IL-4處理組:用白細胞介素-4(IL-4)(20ng/ml)處理細胞24小時,利用熒光定量PCR觀察ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、TNF-α、IL-6的mRNA表達變化;(4)Poly(I:C)處理組:用Poly(I:C)(25μg/ml)處理細胞24小時,利用熒光定量PCR觀察IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β、ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、CD68的mRNA表達變化。3.敲降TRIF后炎癥因子的表達:利用siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞,獲得TRIF表達量特異性下降的星形膠質(zhì)細胞,分別用LPS、IL-4處理敲降TRIF以及未敲降TRIF的星形膠質(zhì)細胞。比較敲降TRIF前后所分泌的炎癥因子mRNA水平表達的變化。結(jié)果:1.免疫組化結(jié)果顯示,經(jīng)過3次傳代后,GFAP陽性標記的原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞純度計數(shù)可達95%,CD11b檢測基本未見陽性標記,可排除小膠質(zhì)細胞的影響。TRIF以及TLR3抗體檢測,部分細胞標記陽性。2.Q-PCR結(jié)果顯示,利用LPS處理后,炎癥促進因子IL-6、iNOS、TNF-α等mRNA表達上升。用IL-4刺激后,炎癥抑制因子ARG1、CD206、IL-10等mRNA表達上升;促炎因子TNF-α和IL-6的mRNA表達下降。用Poly(I:C)刺激后,促炎因子IL-6、iNOS、TNF-α、IL-1β的mRNA表達以及抑炎因子ARG1、CD206、IL-10、IFN-β、CD68的mRNA表達均升高。3.Q-PCR結(jié)果表明,siRNA轉(zhuǎn)染敲降TRIF原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞24小時后,在IL-4的刺激下,可見Arg1和CD206的mRNA表達在敲除TRIF之后明顯下調(diào),TNF-α和IL-6的mRNA表達在敲除之后(siTRIF+IL-4組)較siNC+IL-4組則上升;在siRNA轉(zhuǎn)染原代培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細胞24小時后,利用LPS刺激,IL-6、TNF-α、iNOS、IL-1β的表達在敲除之后的LPS處理組(siTRIF+LPS組)較siNC+LPS組都明顯下降。主要結(jié)論:1.用出生1-2天的C57乳鼠,經(jīng)過3次傳代,能培養(yǎng)出純度高于95%的原代星形膠質(zhì)細胞,可排除小膠質(zhì)細胞的影響,且TLR3以及TRIF在星形膠質(zhì)細胞中也有表達。2.利用LPS、IL4、Poly(I:C)刺激原代星形膠質(zhì)細胞后,各種炎癥因子的mRNA表達變化均有明顯變化,證實原代星形膠質(zhì)細胞可被LPS、IL4、Poly(I:C)等誘導而活化。3.敲降原代星形膠質(zhì)細胞的TRIF后,再分別用IL4和LPS刺激,各炎癥因子的mRNA變化可有明顯的升高或者降低,證實TRIF信號通路在星形膠質(zhì)細胞的活化過程中起重要作用。
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R741

【參考文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 陳寶友;李強;劉愛;周星;;帕金森病患者血清中腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子、可溶性腫瘤壞死因子受體1和S-100B的表達及意義[J];中國老年學雜志;2015年04期

2 魏濤華;楊文明;汪美霞;;抗震止痙膠囊對血瘀風動型帕金森病合并抑郁障礙臨床療效及血清BDNF、5-HT、NE含量的影響[J];中醫(yī)藥臨床雜志;2013年11期

3 黎榮;徐靈源;梁韜;張士軍;李勇文;段小群;;葛根素對帕金森病大鼠黑質(zhì)組織BDNF,TrkB,caspase-3表達的影響[J];中國實驗方劑學雜志;2013年03期

4 夏毅;王海東;丁瑩;康冰;劉衛(wèi)國;;電針合藥物治療帕金森病伴發(fā)抑郁癥及對患者血清BDNF的影響[J];中國針灸;2012年12期

5 趙雪晴;牛平;蘇岑;;帕金森病患者血清TNF-α、sTNFR1、sTNFR2水平的檢測及臨床意義[J];中風與神經(jīng)疾病雜志;2012年10期

6 孫剛順;;早、中、晚期帕金森病患者血清腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子的比較[J];實用臨床醫(yī)藥雜志;2011年09期

7 姬文力;任安經(jīng);謝志芳;章衛(wèi)平;;單只小鼠來源的大腦皮層星形膠質(zhì)細胞的體外原代培養(yǎng)[J];解剖學雜志;2011年02期

8 王長友;李志剛;李金甲;;急性腦梗死患者血清中S100B蛋白含量的動態(tài)變化[J];天津醫(yī)藥;2009年09期

9 沈維高;何欣;王振江;;星形膠質(zhì)細胞的生物學功能及其與疾病的關(guān)系研究進展[J];北華大學學報(自然科學版);2008年06期

10 唐勇;余曙光;陳瑾;;電針對帕金森小鼠黑質(zhì)致密部腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子表達的影響[J];針刺研究;2006年01期

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