本文關(guān)鍵詞：ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG-SNPs及DNA甲基化與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究

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【摘要】：研究背景和目的:腦卒中(stroke)又稱(chēng)腦中風(fēng),它是由于血管破裂或腦組織供血不足導(dǎo)致出血或血栓的形成,引起腦部出血性或缺血性損傷癥狀為主要臨床表現(xiàn)的一種神經(jīng)系統(tǒng)疾病。我國(guó)屬于腦卒中的高發(fā)國(guó)家,其中缺血性腦卒中(Ischemic stroke,IS)占腦卒中的45.5%~75.9%,并且發(fā)病率呈逐年上升的趨勢(shì)。DeCODE研究小組通過(guò)全基因組連鎖分析在冰島人群中首次發(fā)現(xiàn)能引起缺血性腦卒中和心肌梗死發(fā)生的獨(dú)立風(fēng)險(xiǎn)基因—5-脂氧合酶激活蛋白基因(5-lipoxygenase activating protein,ALOX5AP)。ALOX5AP基因定位于13q12-13,編碼合成5-脂氧合酶激活蛋白(FLAP)。FLAP是5-脂氧合酶(5-lipoxyenase,5-LO)的特定激活蛋白,FLAP和5-LO結(jié)合,調(diào)節(jié)炎癥介質(zhì)白三烯(Leukotriene,LT)的生物合成。LT在炎癥疾病的發(fā)生和發(fā)展中發(fā)揮重要作用,可激活白細(xì)胞和單核細(xì)胞,增加血管內(nèi)壁的黏附和通透性等病理機(jī)制,參與動(dòng)脈粥樣硬化的形成。隨著關(guān)聯(lián)研究發(fā)展到全基因組關(guān)聯(lián)分析(Genome-wide association study,GWAS)時(shí)代,目前已經(jīng)在歐洲人群、冰島人群以及日本人群進(jìn)行了IS的GWAS關(guān)聯(lián)研究。但是,GWAS關(guān)聯(lián)研究依然存在種族間的遺傳異質(zhì)性。因此,在后GWAS時(shí)代,應(yīng)該如何進(jìn)行IS的遺傳關(guān)聯(lián)研究面臨重大挑戰(zhàn)。表觀(guān)遺傳學(xué)(epigenetics)為研究IS的發(fā)病機(jī)制提供了新的視角和思路。表觀(guān)遺傳學(xué)是基于不改變DNA序列的基礎(chǔ)上,可遺傳的基因表達(dá)的改變。DNA甲基化是表觀(guān)遺傳學(xué)基因表達(dá)調(diào)控的一種重要機(jī)制,它是以甲基轉(zhuǎn)移酶(DNA methyltransferase,DNMT)催化介導(dǎo),以S-腺苷甲硫氨酸(S-adenosylmethionine,SAM)為供體,將Cp G二核苷酸胞嘧啶環(huán)上5號(hào)碳原子的-H被-CH3取代,形成5-甲基胞嘧啶(5m C)。近年來(lái),DNA甲基化的改變導(dǎo)致基因表達(dá)的異常在IS發(fā)病中的作用成為新的研究熱點(diǎn)。然而,ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)DNA甲基化與IS的相關(guān)性研究目前尚未見(jiàn)報(bào)道。最新研究表明,位于基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島上的SNPs,即Cp G-SNPs,該SNP恰好可以增加或去除相應(yīng)的Cp G位點(diǎn),進(jìn)而影響DNA的甲基化水平,導(dǎo)致等位基因特異的甲基化(Allele-specific DNA methylation,ASM)現(xiàn)象。因此,Cp G-SNPs被認(rèn)為具有調(diào)節(jié)遺傳(SNP)與表觀(guān)遺傳(DNA甲基化)的交互作用,進(jìn)而影響基因表達(dá)功能的潛在機(jī)制。目前,關(guān)于A(yíng)LOX5AP基因Cp G-SNPs及其與DNA甲基化的互作方面的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。因此,本課題提出如下假說(shuō):ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的Cp G-SNPs可能通過(guò)等位基因特異的甲基化(ASM)調(diào)控基因的表達(dá),進(jìn)而影響IS的遺傳易感性。本研究將從遺傳、表觀(guān)遺傳及其交互作用的新角度揭示IS的發(fā)病機(jī)制及其特點(diǎn),為IS的病理學(xué)機(jī)制以及人群防治提供理論依據(jù)。研究對(duì)象:1.1 IS患者的選取隨機(jī)選取在鄭州大學(xué)第一附屬醫(yī)院和鄭州市第一人民醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科自2015年3月至2016年3月住院的IS患者。初始人群:IS患者40例,其中男性26例,女性14例,平均年齡61.1±13.3歲。驗(yàn)證人群:IS患者90例,其中男性51例,女性39例,平均年齡60.5±12.5歲。IS的診斷均符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)第四屆修訂的缺血性腦卒中的診斷標(biāo)準(zhǔn),并經(jīng)臨床檢查(體征、生化檢驗(yàn)、病史、CT/MRI)確診。1.2正常對(duì)照個(gè)體的選取隨機(jī)選取與IS組同期體檢的、性別和年齡相匹配的、且無(wú)腦出血、栓塞性腦梗死等腦血管病史的個(gè)體作為對(duì)照組。初始人群:對(duì)照組40例,其中男性18例,女性22例,平均年齡57.9±14.1歲。驗(yàn)證人群:對(duì)照組96例,其中男性42例,女性54例,平均年齡62.5±13.2歲。所有參與個(gè)體均為河南漢族且無(wú)血緣關(guān)系的人群。本研究獲得鄭州大學(xué)倫理委員會(huì)的批準(zhǔn),所有參與個(gè)體均簽署知情同意書(shū)。研究方法:運(yùn)用天根公司全血基因組提取試劑盒提取外周血基因組DNA和RNA,進(jìn)行RNA反轉(zhuǎn)錄。首先,運(yùn)用實(shí)時(shí)定量RT-PCR技術(shù)檢測(cè)IS組與正常對(duì)照組外周血中ALOX5AP基因m RNA的表達(dá)水平;然后,應(yīng)用重亞硫酸鹽測(cè)序PCR(Bisulfite sequencing PCR,BSP)技術(shù)檢測(cè)ALOX5AP基因啟動(dòng)子DNA甲基化水平;其次,選取ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)Cp G島上rs370679485、rs74043542、rs146576796、rs4073259、rs116205889、rs115053311等6個(gè)SNPs位點(diǎn),采用Sanger測(cè)序技術(shù)進(jìn)行基因分型;最后,對(duì)陽(yáng)性關(guān)聯(lián)Cp G-SNP位點(diǎn)rs4073259采用SNaPshot技術(shù)擴(kuò)大樣本進(jìn)行驗(yàn)證。本研究實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行處理。IS組與對(duì)照組間的定量資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)和單因素方差分析,所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示,對(duì)各組間的等位基因頻率和基因型頻率的差異進(jìn)行χ2檢驗(yàn)。采用SHEsis軟件進(jìn)行Hardy-Weinberg遺傳平衡檢驗(yàn)。以相對(duì)風(fēng)險(xiǎn)度(Odds Ratio,OR)及95%可信區(qū)間(CI)表示對(duì)疾病發(fā)生的相對(duì)危險(xiǎn)度,檢驗(yàn)水準(zhǔn)為α=0.05。P0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。運(yùn)用Bivariate相關(guān)性分析方法,對(duì)IS組中的ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的平均甲基化水平與其m RNA表達(dá)水平進(jìn)行相關(guān)性分析。結(jié)果:1.IS組ALOX5AP基因的m RNA表達(dá)水平(2.23±0.31)顯著高于對(duì)照組(1.03±0.25),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。2.檢測(cè)ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)17個(gè)CpG位點(diǎn),IS組ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的DNA甲基化水平顯著高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);性別分層分析發(fā)現(xiàn),男性IS組的甲基化水平亦顯著高于男性對(duì)照組(P0.05)。3.ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)甲基化水平與mRNA表達(dá)水平呈顯著正相關(guān)(r=0.341,P=0.031)。4.攜帶ALOX5AP基因Cp G-SNP rs4073259位點(diǎn)的GG基因型和G等位基因的個(gè)體降低發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)(P=0.038,OR=0.415,95%CI:0.179-0.960;P=0.043,OR=0.656,95%CI:0.435~0.988)。且在隱性遺傳模式中,GG基因型降低IS的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)(P=0.039,OR=0.471,95%CI:0.228~0.979)。5.對(duì)CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)AA、AG、GG基因型個(gè)體在CpG8的平均甲基化水平進(jìn)行比較,發(fā)現(xiàn)GG基因型個(gè)體的甲基化水平顯著性高于A(yíng)A基因型的個(gè)體,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而GG基因型個(gè)體的m RNA表達(dá)水平顯著低于A(yíng)G、AA基因型的個(gè)體,差異亦具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論:1.促炎基因ALOX5AP的過(guò)表達(dá)可能通過(guò)參與動(dòng)脈壁的炎癥反應(yīng)介導(dǎo)IS的發(fā)生。2.ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)的高甲基化與IS的發(fā)生密切相關(guān),且呈現(xiàn)性別差異。3.ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG-SNP rs4073259位點(diǎn)對(duì)IS的發(fā)生具有保護(hù)作用,攜帶GG基因型及G等位基因的個(gè)體發(fā)生IS的風(fēng)險(xiǎn)降低。4.ALOX5AP基因Cp G-SNP rs4073259位點(diǎn)G等位基因的特異性甲基化(ASM)抑制ALOX5AP基因m RNA的表達(dá),進(jìn)而影響IS的遺傳易感性。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R743.3

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1 張玉超;ALOX5AP基因啟動(dòng)子區(qū)CpG-SNPs及DNA甲基化與缺血性腦卒中的相關(guān)性研究[D];鄭州大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1281677