本文關(guān)鍵詞：人水離子通道蛋白4的表達(dá)及在視神經(jīng)脊髓炎診斷中的應(yīng)用

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【摘要】：背景視神經(jīng)脊髓炎(neuromyelitis optica,NMO)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system,CNS)的嚴(yán)重性脫髓鞘疾病,主要損傷視神經(jīng)和脊髓,多起病急驟且進(jìn)展迅速,嚴(yán)重危害人類的健康。自1894年NMO這一概念被提出以來,對于NMO是一獨立的疾病還是多發(fā)性硬化(mutiple sclerosis,MS)的亞型一直存在較大的爭議。2004年Lennon等發(fā)現(xiàn)抗水離子通道蛋白4(aquaporin-4,AQP4)抗體是NMO的特異性致病抗體,從而證明了NMO是不同于MS的一種體液免疫介導(dǎo)的自身免疫性疾病。由于NMO和MS的治療和預(yù)后存在較大的差異,因此,檢測疑似病例血清中的抗AQP4抗體水平對于NMO和MS的鑒別診斷、治療及預(yù)后判斷具有明顯的指導(dǎo)意義。迄今為止國內(nèi)尚缺乏靈敏度高和特異性強的試劑盒用于檢測AQP4抗體,建立一種適用于國人NMO中自身抗體的檢測方法是非常有必要的。目前已經(jīng)證明該抗體的主要結(jié)合位點是其靶抗原AQP4的胞外區(qū),克隆表達(dá)AQP4的胞外區(qū)有望為抗AQP4抗體的檢測提供原料。另外通過真核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)AQP4全長蛋白,比較原核表達(dá)胞外區(qū)蛋白和真核表達(dá)全長蛋白在檢測AQP4抗體中的差異。目的1.通過構(gòu)建p ET32a(+)-AQP4的胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒,表達(dá)AQP4的胞外區(qū)蛋白,建立一種可用于檢測AQP4抗體的ELISA方法。2.利用重組質(zhì)粒p CMV6-AC-GFP-AQP4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,表達(dá)AQP4全長蛋白,建立用于檢測抗AQP4抗體的CBA方法。方法1.利用生物信息學(xué)軟件TMHMM 2.0分析人AQP4的結(jié)構(gòu),并根據(jù)大腸桿菌的密碼子的偏好性設(shè)計合成AQP4胞外區(qū)的寡核苷酸序列。2.利用分子克隆技術(shù)構(gòu)建p ET32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒。3.構(gòu)建的重組表達(dá)質(zhì)粒通過轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)菌株,利用IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,然后通過SDS-PAGE電泳分析表達(dá)產(chǎn)物。4.大規(guī)模培養(yǎng)宿主菌并誘導(dǎo)表達(dá)目的蛋白,利用Ni2+離子親和層析技術(shù)進(jìn)行蛋白質(zhì)的純化,目的蛋白經(jīng)過SDS-PAGE電泳和Western blot的鑒定。5.利用純化酶切的目的蛋白包被ELISA微孔板,通過國際公認(rèn)檢測AQP4抗體的金標(biāo)準(zhǔn)間接免疫熒光法篩選的陽性血清對表達(dá)蛋白的生物活性進(jìn)行評估。6.通過脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將重組質(zhì)粒p CMV6-AC-GFP-AQP4轉(zhuǎn)染HEK293細(xì)胞,并同時用p CMV6-AC-GFP轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為對照。對轉(zhuǎn)染細(xì)胞進(jìn)行固定后進(jìn)行后通過間接免疫熒光法檢測NMO患者患者血清中的抗體。結(jié)果1.限制性內(nèi)切酶和測序分析均鑒定重組表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建正確。2.經(jīng)過SDS-PAGE電泳鑒定,構(gòu)建的p ET-32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒的宿主菌經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白可以可溶性的表達(dá)形式在菌體的上清中表達(dá),其相對分子量均在26KD左右。3.誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白均可經(jīng)過一步親和層析達(dá)到較高的純度。4.誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白均可與抗His-tag的抗體進(jìn)行特異性的結(jié)合。5.表達(dá)的AQP4的胞外區(qū)不能與抗AQP4抗體特異性結(jié)合。6.轉(zhuǎn)染GFP空質(zhì)粒的細(xì)胞綠色熒光充滿整個細(xì)胞,而轉(zhuǎn)染GFP-AQP4的細(xì)胞綠色熒光僅定位于細(xì)胞膜。7.轉(zhuǎn)染GFP-AQP4的細(xì)胞能與NMO患者血清中的抗AQP4抗體特異性結(jié)合。結(jié)論1.成功構(gòu)建了p ET-32a(+)-AQP4胞外區(qū)的原核表達(dá)質(zhì)粒并獲得了一定純度的蛋白,為后續(xù)用于視神經(jīng)脊髓炎的體外診斷奠定了基礎(chǔ)。2.僅表達(dá)AQP4的胞外區(qū)蛋白,不能與抗AQP4抗體進(jìn)行特異性結(jié)合,這可能與破壞了AQP4的三維空間結(jié)構(gòu)及自身是否形成OAP結(jié)構(gòu)相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R744.52

【共引文獻(xiàn)】

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中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

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本文編號：1268694