本文關(guān)鍵詞：RGMa對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管再生的影響及機(jī)制探討

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【摘要】：背景與目的:缺血性腦血管疾病具有高發(fā)病率、致殘率、死亡率和復(fù)發(fā)率的特點(diǎn)。卒中后的血管再生是腦梗死后早期代償?shù)闹匾^程,能改善局部血流供應(yīng)、幫助清除壞死組織,為神經(jīng)元修復(fù)、再生創(chuàng)造良好的微環(huán)境,從而促進(jìn)神經(jīng)功能康復(fù)。排斥導(dǎo)向分子a(Repulsive guidance molecule,RGMa)是一種軸突導(dǎo)向因子,與其高親和力受體Neogenin結(jié)合后介導(dǎo)軸突生長抑制、排斥性導(dǎo)向作用,并參與神經(jīng)增殖、分化、存活等過程。近期研究發(fā)現(xiàn),血管和神經(jīng)系統(tǒng)具有一定的相似性,它們之間存在一些共同的的分子信號。例如經(jīng)典的軸突導(dǎo)向因子Netrin家族,參與了血管細(xì)胞的黏附、游走、增殖、分化甚至凋亡的調(diào)控,在神經(jīng)和血管發(fā)生過程中均能發(fā)揮調(diào)節(jié)作用。最近有研究報(bào)道RGMa通過Neogenin下游的FAK去磷酸化抑制人臍動脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical artery endothelial cells,HUAEC)管狀結(jié)構(gòu)形成,從而抑制血管生成,但目前關(guān)于RGMa在腦缺血損傷后血管系統(tǒng)中的作用尚待闡明。缺血性腦卒中后的血管再生涉及多種細(xì)胞生長因子,目前對血管內(nèi)皮細(xì)胞生長因子(Vascular endothelial growth factor,VEGF)和血管生成素(Angiopoietin,Ang)家族的功能研究最為深入。VEGF具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖、粘附、遷移和增加血管通透性的生物學(xué)活性,ang2與vegf協(xié)同作用,觸發(fā)血管的再生,ang1則促進(jìn)結(jié)構(gòu)不完整的新生血管形成穩(wěn)定成熟的血管形態(tài)。腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子(brainderivedneurotrophicfactor,bdnf)除了能促進(jìn)神經(jīng)再生,還具有促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞存活和再生的作用。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)應(yīng)用重組腺病毒rad-shrgma進(jìn)行特異性rna干擾可顯著降低rgma表達(dá)。此外,rgma的受體neogenin,胞外結(jié)構(gòu)含有4個免疫球蛋白結(jié)構(gòu)域(4ig)和6個纖維蛋白Ⅲ樣結(jié)構(gòu)域(6fnⅢ),有文獻(xiàn)報(bào)道6fnⅢ是neogenin上與rgma結(jié)合的區(qū)域。因此本研究采用重組腺病毒對缺血再灌注大鼠腦組織rgma的轉(zhuǎn)錄進(jìn)行rna干擾,從而抑制rgma表達(dá),觀察血管再生情況,探討rna干擾rgma對大鼠局灶性缺血再灌注后血管再生的影響。后期研究中采用6fnⅢ對rgma/neogenin通路進(jìn)行干預(yù),觀察大鼠腦缺血再灌注損傷后缺血皮質(zhì)vegf、ang1、ang2、bdnf的表達(dá)水平,探討rgma對大鼠腦缺血再灌注損傷后血管再生影響的潛在的機(jī)制。方法:1.將25只雄性sd大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(s)、腦缺血組(i/r)、腦缺血+重組腺病毒干預(yù)組(i/r+rad-shrgma)及腦缺血+空載體腺病毒注射組(i/r+rad-hk),腦缺血組(i/r)再分為2天和7天亞組。顱內(nèi)立體定位注射腺病毒建立rna干擾rgma重組腺病毒轉(zhuǎn)染動物模型后,立即行大腦中動脈閉塞(mcao)/再灌注手術(shù)。于再灌注后第2天進(jìn)行免疫熒光定位rgma及其受體neogenin在缺血腦組織神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞上的表達(dá);rna干擾rgma后第7天進(jìn)行免疫組化法標(biāo)記cd31計(jì)數(shù)缺血側(cè)皮質(zhì)微血管數(shù),免疫熒光雙標(biāo)ki67/cd31觀察缺血側(cè)皮質(zhì)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖情況;所有大鼠在處死前進(jìn)行神經(jīng)功能評分。2.將30只雄性sd大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組(s)、腦缺血組(i/r)、腦缺血+6fnⅢ不同濃度干預(yù)組(i/r+6fnⅢ(h):1μg/μl;i/r+6fnⅢ(m):0.5μg/μl;i/r+6fnⅢ(l):0.25μg/μl)及腦缺血+生理鹽水對照組(i/r+ns)六個組,分別予以等體積不同濃度梯度的6fnⅢ或生理鹽水進(jìn)行側(cè)腦室注射,通過蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測rgma的蛋白表達(dá)水平,探索6fnⅢ的最佳給藥濃度。然后,將90只大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組(s)、腦缺血組(i/r)、腦缺血+重組腺病毒干預(yù)組(i/r+rad-shrgma)、腦缺血+6fnⅢ組(i/r+6fnⅢ)、腦缺血+空載體重組腺病毒注射組(i/r+rad-hk)及腦缺血+生理鹽水對照組(i/r+ns)六組,各組再分為2天、7天、14天亞組。蛋白質(zhì)印跡實(shí)驗(yàn)檢測再灌注后第2、7、14天缺血側(cè)皮質(zhì)vegf、ang1、ang2、bdnf蛋白表達(dá)水平。結(jié)果:1.在腦缺血再灌注損傷后,rgma及其受體neogenin在神經(jīng)元、血管內(nèi)皮細(xì)胞上均有表達(dá);rna干擾抑制rgma表達(dá)后,微血管數(shù)量明顯增多,血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖明顯,神經(jīng)功能缺損明顯改善。2.6fnⅢ能顯著降低rgma蛋白水平,其作用與濃度呈正相關(guān),且中濃度組與高濃度組間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,選擇中濃度組6fnⅢ(0.5μg/μl)作為給藥濃度;6fnⅢ干預(yù)組與rna干擾rgma腺病毒組vegf、ang1、ang2、bdnf的蛋白表達(dá)水平均較對照組明顯升高。結(jié)論:1.RGMa可能在缺血再灌注損傷后血管再生過程中發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用,采用重組腺病毒rAd-shRGMa進(jìn)行RNA干擾抑制RGMa表達(dá)則能促進(jìn)血管的再生,改善神經(jīng)功能障礙。2.外源性6FNⅢ肽段能有效降低RGMa蛋白水平,干預(yù)RGMa/Neogenin通路;RGMa可能通過受體Neogenin在缺血再灌注損傷后拮抗VEGF、Ang1、Ang2、BDNF表達(dá)從而對血管再生過程發(fā)揮負(fù)性調(diào)節(jié)作用。
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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本文編號：1242379