發(fā)布時(shí)間：2017-11-24 10:25

  本文關(guān)鍵詞：腦卒中與腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO相關(guān)性的初步研究

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【摘要】：研究背景隨著微生物組學(xué)和代謝組學(xué)技術(shù)的發(fā)展,微生物組學(xué)和代謝組學(xué)研究越來越深入。人體微生物包括了口腔微生物群、腸道微生物群、陰道微生物群等。其中,腸道微生物群(主要是腸道菌群)及其代謝產(chǎn)物與人體疾病相關(guān)性研究己成為近年微生物學(xué)研究的熱點(diǎn)。截止至目前,腸道菌群己被認(rèn)為在多種疾病(包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝以及心腦血管疾病等)的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。而以動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)為基礎(chǔ)病變的多種疾病,包括腦卒中和冠心病,依然是我國(guó)疾病防治的重點(diǎn)和難點(diǎn)。我國(guó)每年有150萬～200萬新發(fā)腦卒中的病例,校正年齡后的年腦卒中發(fā)病率為(116～219)/10萬人口,年腦卒中死亡率為(58-142)/10萬人口。我國(guó)現(xiàn)存腦血管病患者700余萬人,其中約70%為的缺血性腦卒中。而缺血性腦卒中的病因主要為AS。根據(jù)TOAST分型(Trial of Org 10172 Acute Stroke Treatment,一種國(guó)際上使用最為廣泛的缺血性腦卒中病因?qū)W分型方法)我們可以將缺血性腦卒中分為5種亞型：大動(dòng)脈粥樣硬化性(large -artery atherosclerosis, LAA)、心源性栓塞(cardioembolism,CE)、小動(dòng)脈閉塞性(small-artery occlusion lacunar, SAA)、其他病因(stroke of other demonstratedetiology, SOE)和病因不明(stroke of otherundemonstrated etiology, SUE)。王擁軍教授團(tuán)隊(duì)曾對(duì)天壇醫(yī)院300名首發(fā)缺血性腦卒中患者進(jìn)行TOAST分型,結(jié)果大動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中(LAA)占40%,明顯高于其它4型。除此之外,LAA不但發(fā)病率高,其死亡率也較其它亞型高。以南京卒中登記研究為例,該研究最終共納入了752例首次發(fā)生卒中的患者,其中71%為缺血性腦卒中,統(tǒng)計(jì)一年累計(jì)死亡率為13.6%；各類卒中死亡率各不相同,小動(dòng)脈卒中的死亡率約為7.3%為最低,而LAA死亡率高達(dá)15.8%,為死亡率最高的卒中類型。2011年,來自美國(guó)克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心由Hazen教授帶領(lǐng)的一個(gè)研究團(tuán)隊(duì),首先報(bào)道了腸道菌群可通過其代謝產(chǎn)物氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide, TMAO)參與AS的發(fā)生發(fā)展,從而促使心腦血管疾病(主要是以AS為基礎(chǔ)的心腦血管疾病,如動(dòng)脈粥樣硬化性腦卒中、冠心病等)的發(fā)生。該途徑相比于腸道菌群通過影響肥胖、高血壓和糖尿病等心腦血管疾病高危因素間接促進(jìn)心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展要來得更加直接。該團(tuán)隊(duì)發(fā)現(xiàn),來自日常飲食中的磷脂酰膽堿和左旋肉堿進(jìn)入腸道后在腸道菌群的作用下可代謝為三甲胺(Trimethylamine, TMA); TMA可在腸道吸收入血,然后在肝臟黃素單加氧酶(Flavin-containing Monooxygenase 3, FMO3)的作用下氧化為TMAO, TMAO可進(jìn)一步通過促進(jìn)巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為泡沫細(xì)胞等途徑促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展,進(jìn)而導(dǎo)致心腦血管疾病發(fā)生。另外,TMAO業(yè)已被多項(xiàng)研究證明,其血漿濃度升高與心衰、慢性腎臟疾病等的遠(yuǎn)期不良預(yù)后相關(guān),血漿高水平的TMAO往往預(yù)示著預(yù)后不良。除了TMAO途徑,2012年發(fā)表于Nature Com的一項(xiàng)宏基因組學(xué)研究表明,癥狀性AS與腸道菌群改變相關(guān)；該研究發(fā)現(xiàn)癥狀性AS患者(患者罹患小卒中、短暫性腦缺血發(fā)作/TIA或視網(wǎng)膜動(dòng)脈閉塞,影像學(xué)證實(shí)存在顱內(nèi)外斑塊)與正常對(duì)照相比,其腸道菌群有益菌(如柔嫩梭菌)含量減少,而有害菌(如Collinsella)含量增高,且菌群編碼肽聚糖等有害物質(zhì)的基因表達(dá)增多。上述研究表明,腸道菌群及其代謝產(chǎn)物TMAO是動(dòng)脈粥樣硬化性疾病潛在的一個(gè)新的預(yù)防和治療靶點(diǎn)。然而,迄今為止,國(guó)內(nèi)還罕見關(guān)于大動(dòng)脈粥樣硬化性缺血性腦卒中／短暫性腦缺血發(fā)作(LAA/TIA)患者腸道菌群及血漿TMAO水平改變的研究。研究目的和意義為了研究LAA/TIA與腸道菌群及血漿TMAO水平間的相關(guān)關(guān)系,我們建立了一個(gè)病例對(duì)照研究。本研究擬分析LAA/TIA患者腸道菌群改變情況,初步了解腸道菌群與卒中事件的相關(guān)性；比較卒中患者與正常對(duì)照的血漿TMAO水平差異,揭示血漿TMAO水平與腸道菌群可能存在的相關(guān)關(guān)系,并為將來的進(jìn)一步研究建立理論依據(jù)及實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。研究方法本病例對(duì)照研究連續(xù)納入了從2014年2月至2015年2月入住南方醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科的急性腦卒中/TIA患者。初步納入的患者將根據(jù)納入和排除標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)格篩選合格病例,最終診斷為急性缺血性腦卒中,且TOAST分型為L(zhǎng)AA的患者將進(jìn)入后續(xù)分析；而最終診斷為TIA,且有明確顱內(nèi)外動(dòng)脈粥樣硬化斑塊的患者也將納入后續(xù)分析。結(jié)合各項(xiàng)臨床數(shù)據(jù)證實(shí)與AS無關(guān)的缺血性腦卒中(如心源性等)和無明顯顱內(nèi)外AS斑塊證據(jù)的TIA患者將被剔除。對(duì)照組參與者來源于在南方醫(yī)院進(jìn)行健康體檢的人群,對(duì)照組人群均己完善頸動(dòng)脈彩超(CDFI)、經(jīng)顱彩色多普勒(TCD)和超聲心動(dòng)圖(UCG)等檢查。所有患者均采集了入院后的首個(gè)空腹血液樣本(使用EDTA抗凝采血管)及入院48小時(shí)內(nèi)的首個(gè)糞便樣本。對(duì)照組人群收集其體檢當(dāng)天的空腹血樣及糞便樣本。所有血液樣本收集后,在低溫下運(yùn)送至實(shí)驗(yàn)室,然后在4℃,3000轉(zhuǎn)／分鐘下低溫離心10分鐘,隨后抽取上清(血漿)凍存于-80℃。所有新鮮采集的糞便樣本將及時(shí)凍存于-80℃,直至進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。糞便樣本總DNA(腸道菌群總DNA)將嚴(yán)格根據(jù)說明書使用MOBIO強(qiáng)力土壤DNA提取試劑盒(MOBIO)進(jìn)行提取。所獲得的DNA產(chǎn)物及時(shí)凍存于-20℃以備后期進(jìn)行PCR擴(kuò)增使用。在獲得腸道菌群總DNA產(chǎn)物后,我們以16srRNA V4可變區(qū)域帶barcode的通用引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,本研究所用上游引物是514F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA),下游引物是805R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。在獲得PCR產(chǎn)物后,我們將抽取少量產(chǎn)物進(jìn)行跑膠以確定獲得目標(biāo)條帶(提示DNA擴(kuò)增成功)。最終,所有的PCR產(chǎn)物經(jīng)定量混合后,統(tǒng)一送至華大基因公司(深圳,中國(guó))進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序方法采用Illumina Miseq (PE 150)測(cè)序技術(shù)。在測(cè)序前原始序列將利用BIPES技術(shù)進(jìn)行預(yù)處理。在獲得腸道菌群總DNA測(cè)序結(jié)果后,我們使用QIIME(1.8.0)進(jìn)行了腸道菌群的基礎(chǔ)分析。利用Usearch算法(Usearch algorithm)所有的序列被歸類為OTUs。OTU (Operational Taxonomic Units,分類操作單元)是人為的在系統(tǒng)發(fā)生學(xué)研究或群體遺傳學(xué)研究中,為了便于進(jìn)行分析,給某一個(gè)分類單元(品系,種,屬,分組等)設(shè)置的同一標(biāo)志。在生物學(xué)信息分析中,一般來說,測(cè)序得到的每一條序列來自一個(gè)菌。要了解一個(gè)樣品測(cè)序結(jié)果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息,就需要對(duì)序列進(jìn)行歸類操作(cluster)。通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組,一個(gè)小組就是一個(gè)OTU,或者說一個(gè)OTU代表一種細(xì)菌。通常在97%的相似水平下的OTU進(jìn)行生物信息統(tǒng)計(jì)分析。每個(gè)OTU的代表性序列根據(jù)序列的頻率進(jìn)行確定；代表序列利用PyNAST算法(PyNAST algorithms)進(jìn)行校準(zhǔn)排齊處理；將去除嵌合體后的OTU中的代表序列插入FastTree軟件中,以生成所有OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹,并在此基礎(chǔ)上進(jìn)行a-和β-多樣性分析。根據(jù)OTU數(shù)據(jù)的特點(diǎn),隨機(jī)森林分類模型利用R軟件包來分類來自患者和健康對(duì)照的樣本。為了確定LAA/TIA患者和對(duì)照組具有顯著差異的細(xì)菌類群,我們?cè)趦山M間進(jìn)行了LEfSe (linear discriminate analysis size effect)分析以比較兩組間的菌群差異。在本次分析中,我們將LDA (linear discriminate analysis,線性判別分析)臨界值設(shè)置為3。在進(jìn)行TMAO檢測(cè)前,所有血漿樣本均保持在-80℃環(huán)境下凍存。血漿TMAO測(cè)定采用克利夫蘭醫(yī)學(xué)中心研究人員建立的穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(LC-MS) (6,460 Series Triple Quadrupole LC/MS, Agilent, USA)進(jìn)行定量檢測(cè)。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析利用R(3.0.2)完成。在本研究中,各項(xiàng)納入研究指標(biāo)均因未能同時(shí)符合Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗(yàn)和Bartlett方差齊性檢驗(yàn),故我們采用非參數(shù)檢驗(yàn)(Wilcoxon秩和檢驗(yàn)方法或Kruskal Wallis秩和檢驗(yàn)方法)來對(duì)兩組及多組間的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,成對(duì)樣本則用Nemenyi檢驗(yàn)法。分類變量采用卡方檢驗(yàn)。由于微生物組數(shù)據(jù)的多維性,我們?cè)赒IIME 1.8.0平臺(tái)上進(jìn)行微生物組的Adonis檢驗(yàn)。P0.05表示有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果在本研究中,最終共有435名急性缺血性腦卒中/TIA患者被初步納入研究,經(jīng)過后期的篩選(嚴(yán)格執(zhí)行納入及排除標(biāo)準(zhǔn)),最終有322名LAA/TIA患者符合納入標(biāo)準(zhǔn)。所有322名患者均采集了入院后首個(gè)空腹血漿樣本,其中141名患者在入院48小時(shí)內(nèi)留取了合格的糞便樣本。對(duì)照組最終納入了符合入組條件的231名體檢者,其中97名對(duì)照組人員于體檢當(dāng)天留取了合格的新鮮糞便樣本。首先,我們根據(jù)對(duì)照組頸動(dòng)脈彩超結(jié)果是否存在AS改變將對(duì)照組分為3個(gè)亞組：明確存在頸AS斑塊形成組(AS亞組)、頸動(dòng)脈內(nèi)膜中層厚度(intima-media thickness)增加組(IMT亞組)及未發(fā)現(xiàn)明顯AS改變組(Non-AS亞組)。我們分析比較了對(duì)照組三個(gè)亞組間的血漿TMAO水平及腸道菌群,結(jié)果表明,三組間血漿TMAO水平及腸道菌群均未見顯著性差異。上述分析結(jié)果說明,在正常對(duì)照組中,AS與腸道菌群結(jié)構(gòu)和血漿TMAO水平均未見明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)相關(guān)關(guān)系。然而,無論是利用傳統(tǒng)的PCoA (principal coordinate analysis,主坐標(biāo)分析)分析法,還是基于隨機(jī)森林算法的機(jī)器學(xué)習(xí)分析法,LAA/TIA患者組(疾病組)的腸道菌群結(jié)構(gòu)則表現(xiàn)出了明顯不同于對(duì)照組的腸道菌群結(jié)構(gòu)。其中,α-多樣性分析表明疾病組具有較對(duì)照組明顯多樣化的腸道菌群�；谖醇訖�(quán)的UniFrac距離分析,我們發(fā)現(xiàn)相比于Non-AS和IMT組,對(duì)照組AS亞組的腸道菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)表現(xiàn)出了傾向于類似LAA/TIA患者腸道菌群失衡改變的趨勢(shì)。這個(gè)結(jié)果說明,對(duì)照組AS亞組的腸道菌群結(jié)構(gòu)已經(jīng)出現(xiàn)了輕度的紊亂表現(xiàn),且這種紊亂與疾病組相似。另外,LEfSe分析表明,疾病組患者腸道菌群含有更多的機(jī)會(huì)致病菌(有害菌),如腸桿菌屬、巨型球菌屬、脫硫弧菌屬等,而被廣泛認(rèn)可的有益菌如擬桿菌屬、普氏菌屬和柔嫩梭菌屬含量明顯下降。且這種菌群紊亂的改變?cè)谧渲休^為嚴(yán)重的患者中更加明顯。與此同時(shí),通過檢測(cè)兩組人群的血漿TMAO水平,我們發(fā)現(xiàn),與預(yù)期的結(jié)果相反,LAA/TIA患者血漿TMAO水平非但沒有出現(xiàn)升高,反而出現(xiàn)了較對(duì)照組顯著下降的現(xiàn)象(P0.05)。結(jié)論LAA/TIA患者與對(duì)照組相比出現(xiàn)了明顯的腸道菌群紊亂的表現(xiàn),其腸道菌群有害菌比例升高,而有益菌含量較對(duì)照組明顯降低；且疾病組血漿TMAO水平明顯低于對(duì)照組。
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R743.3

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本文編號(hào)：1221961