本文關鍵詞：腦卒中與腸道菌群及其代謝產物TMAO相關性的初步研究

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【摘要】：研究背景隨著微生物組學和代謝組學技術的發(fā)展,微生物組學和代謝組學研究越來越深入。人體微生物包括了口腔微生物群、腸道微生物群、陰道微生物群等。其中,腸道微生物群(主要是腸道菌群)及其代謝產物與人體疾病相關性研究己成為近年微生物學研究的熱點。截止至目前,腸道菌群己被認為在多種疾病(包括肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪肝以及心腦血管疾病等)的發(fā)生發(fā)展中起著重要的作用。而以動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)為基礎病變的多種疾病,包括腦卒中和冠心病,依然是我國疾病防治的重點和難點。我國每年有150萬～200萬新發(fā)腦卒中的病例,校正年齡后的年腦卒中發(fā)病率為(116～219)/10萬人口,年腦卒中死亡率為(58-142)/10萬人口。我國現(xiàn)存腦血管病患者700余萬人,其中約70%為的缺血性腦卒中。而缺血性腦卒中的病因主要為AS。根據(jù)TOAST分型(Trial of Org 10172 Acute Stroke Treatment,一種國際上使用最為廣泛的缺血性腦卒中病因學分型方法)我們可以將缺血性腦卒中分為5種亞型：大動脈粥樣硬化性(large -artery atherosclerosis, LAA)、心源性栓塞(cardioembolism,CE)、小動脈閉塞性(small-artery occlusion lacunar, SAA)、其他病因(stroke of other demonstratedetiology, SOE)和病因不明(stroke of otherundemonstrated etiology, SUE)。王擁軍教授團隊曾對天壇醫(yī)院300名首發(fā)缺血性腦卒中患者進行TOAST分型,結果大動脈粥樣硬化性腦卒中(LAA)占40%,明顯高于其它4型。除此之外,LAA不但發(fā)病率高,其死亡率也較其它亞型高。以南京卒中登記研究為例,該研究最終共納入了752例首次發(fā)生卒中的患者,其中71%為缺血性腦卒中,統(tǒng)計一年累計死亡率為13.6%；各類卒中死亡率各不相同,小動脈卒中的死亡率約為7.3%為最低,而LAA死亡率高達15.8%,為死亡率最高的卒中類型。2011年,來自美國克利夫蘭醫(yī)學中心由Hazen教授帶領的一個研究團隊,首先報道了腸道菌群可通過其代謝產物氧化三甲胺(Trimethylamine-N-oxide, TMAO)參與AS的發(fā)生發(fā)展,從而促使心腦血管疾病(主要是以AS為基礎的心腦血管疾病,如動脈粥樣硬化性腦卒中、冠心病等)的發(fā)生。該途徑相比于腸道菌群通過影響肥胖、高血壓和糖尿病等心腦血管疾病高危因素間接促進心腦血管疾病的發(fā)生發(fā)展要來得更加直接。該團隊發(fā)現(xiàn),來自日常飲食中的磷脂酰膽堿和左旋肉堿進入腸道后在腸道菌群的作用下可代謝為三甲胺(Trimethylamine, TMA); TMA可在腸道吸收入血,然后在肝臟黃素單加氧酶(Flavin-containing Monooxygenase 3, FMO3)的作用下氧化為TMAO, TMAO可進一步通過促進巨噬細胞轉化為泡沫細胞等途徑促進AS的發(fā)生發(fā)展,進而導致心腦血管疾病發(fā)生。另外,TMAO業(yè)已被多項研究證明,其血漿濃度升高與心衰、慢性腎臟疾病等的遠期不良預后相關,血漿高水平的TMAO往往預示著預后不良。除了TMAO途徑,2012年發(fā)表于Nature Com的一項宏基因組學研究表明,癥狀性AS與腸道菌群改變相關；該研究發(fā)現(xiàn)癥狀性AS患者(患者罹患小卒中、短暫性腦缺血發(fā)作/TIA或視網膜動脈閉塞,影像學證實存在顱內外斑塊)與正常對照相比,其腸道菌群有益菌(如柔嫩梭菌)含量減少,而有害菌(如Collinsella)含量增高,且菌群編碼肽聚糖等有害物質的基因表達增多。上述研究表明,腸道菌群及其代謝產物TMAO是動脈粥樣硬化性疾病潛在的一個新的預防和治療靶點。然而,迄今為止,國內還罕見關于大動脈粥樣硬化性缺血性腦卒中／短暫性腦缺血發(fā)作(LAA/TIA)患者腸道菌群及血漿TMAO水平改變的研究。研究目的和意義為了研究LAA/TIA與腸道菌群及血漿TMAO水平間的相關關系,我們建立了一個病例對照研究。本研究擬分析LAA/TIA患者腸道菌群改變情況,初步了解腸道菌群與卒中事件的相關性；比較卒中患者與正常對照的血漿TMAO水平差異,揭示血漿TMAO水平與腸道菌群可能存在的相關關系,并為將來的進一步研究建立理論依據(jù)及實驗基礎。研究方法本病例對照研究連續(xù)納入了從2014年2月至2015年2月入住南方醫(yī)院神經內科的急性腦卒中/TIA患者。初步納入的患者將根據(jù)納入和排除標準嚴格篩選合格病例,最終診斷為急性缺血性腦卒中,且TOAST分型為LAA的患者將進入后續(xù)分析；而最終診斷為TIA,且有明確顱內外動脈粥樣硬化斑塊的患者也將納入后續(xù)分析。結合各項臨床數(shù)據(jù)證實與AS無關的缺血性腦卒中(如心源性等)和無明顯顱內外AS斑塊證據(jù)的TIA患者將被剔除。對照組參與者來源于在南方醫(yī)院進行健康體檢的人群,對照組人群均己完善頸動脈彩超(CDFI)、經顱彩色多普勒(TCD)和超聲心動圖(UCG)等檢查。所有患者均采集了入院后的首個空腹血液樣本(使用EDTA抗凝采血管)及入院48小時內的首個糞便樣本。對照組人群收集其體檢當天的空腹血樣及糞便樣本。所有血液樣本收集后,在低溫下運送至實驗室,然后在4℃,3000轉／分鐘下低溫離心10分鐘,隨后抽取上清(血漿)凍存于-80℃。所有新鮮采集的糞便樣本將及時凍存于-80℃,直至進行后續(xù)實驗。糞便樣本總DNA(腸道菌群總DNA)將嚴格根據(jù)說明書使用MOBIO強力土壤DNA提取試劑盒(MOBIO)進行提取。所獲得的DNA產物及時凍存于-20℃以備后期進行PCR擴增使用。在獲得腸道菌群總DNA產物后,我們以16srRNA V4可變區(qū)域帶barcode的通用引物進行PCR擴增,本研究所用上游引物是514F (GTGCCAGCMGCCGCGGTAA),下游引物是805R(GGACTACHVGGGTWTCTAAT)。在獲得PCR產物后,我們將抽取少量產物進行跑膠以確定獲得目標條帶(提示DNA擴增成功)。最終,所有的PCR產物經定量混合后,統(tǒng)一送至華大基因公司(深圳,中國)進行測序。測序方法采用Illumina Miseq (PE 150)測序技術。在測序前原始序列將利用BIPES技術進行預處理。在獲得腸道菌群總DNA測序結果后,我們使用QIIME(1.8.0)進行了腸道菌群的基礎分析。利用Usearch算法(Usearch algorithm)所有的序列被歸類為OTUs。OTU (Operational Taxonomic Units,分類操作單元)是人為的在系統(tǒng)發(fā)生學研究或群體遺傳學研究中,為了便于進行分析,給某一個分類單元(品系,種,屬,分組等)設置的同一標志。在生物學信息分析中,一般來說,測序得到的每一條序列來自一個菌。要了解一個樣品測序結果中的菌種、菌屬等數(shù)目信息,就需要對序列進行歸類操作(cluster)。通過歸類操作,將序列按照彼此的相似性分歸為許多小組,一個小組就是一個OTU,或者說一個OTU代表一種細菌。通常在97%的相似水平下的OTU進行生物信息統(tǒng)計分析。每個OTU的代表性序列根據(jù)序列的頻率進行確定；代表序列利用PyNAST算法(PyNAST algorithms)進行校準排齊處理；將去除嵌合體后的OTU中的代表序列插入FastTree軟件中,以生成所有OTU代表序列的系統(tǒng)發(fā)育進化樹,并在此基礎上進行a-和β-多樣性分析。根據(jù)OTU數(shù)據(jù)的特點,隨機森林分類模型利用R軟件包來分類來自患者和健康對照的樣本。為了確定LAA/TIA患者和對照組具有顯著差異的細菌類群,我們在兩組間進行了LEfSe (linear discriminate analysis size effect)分析以比較兩組間的菌群差異。在本次分析中,我們將LDA (linear discriminate analysis,線性判別分析)臨界值設置為3。在進行TMAO檢測前,所有血漿樣本均保持在-80℃環(huán)境下凍存。血漿TMAO測定采用克利夫蘭醫(yī)學中心研究人員建立的穩(wěn)定同位素稀釋液相色譜質譜聯(lián)用技術(LC-MS) (6,460 Series Triple Quadrupole LC/MS, Agilent, USA)進行定量檢測。統(tǒng)計學分析利用R(3.0.2)完成。在本研究中,各項納入研究指標均因未能同時符合Shapiro-Wilk正態(tài)性檢驗和Bartlett方差齊性檢驗,故我們采用非參數(shù)檢驗(Wilcoxon秩和檢驗方法或Kruskal Wallis秩和檢驗方法)來對兩組及多組間的數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析,成對樣本則用Nemenyi檢驗法。分類變量采用卡方檢驗。由于微生物組數(shù)據(jù)的多維性,我們在QIIME 1.8.0平臺上進行微生物組的Adonis檢驗。P0.05表示有統(tǒng)計學意義。結果在本研究中,最終共有435名急性缺血性腦卒中/TIA患者被初步納入研究,經過后期的篩選(嚴格執(zhí)行納入及排除標準),最終有322名LAA/TIA患者符合納入標準。所有322名患者均采集了入院后首個空腹血漿樣本,其中141名患者在入院48小時內留取了合格的糞便樣本。對照組最終納入了符合入組條件的231名體檢者,其中97名對照組人員于體檢當天留取了合格的新鮮糞便樣本。首先,我們根據(jù)對照組頸動脈彩超結果是否存在AS改變將對照組分為3個亞組：明確存在頸AS斑塊形成組(AS亞組)、頸動脈內膜中層厚度(intima-media thickness)增加組(IMT亞組)及未發(fā)現(xiàn)明顯AS改變組(Non-AS亞組)。我們分析比較了對照組三個亞組間的血漿TMAO水平及腸道菌群,結果表明,三組間血漿TMAO水平及腸道菌群均未見顯著性差異。上述分析結果說明,在正常對照組中,AS與腸道菌群結構和血漿TMAO水平均未見明顯的統(tǒng)計學相關關系。然而,無論是利用傳統(tǒng)的PCoA (principal coordinate analysis,主坐標分析)分析法,還是基于隨機森林算法的機器學習分析法,LAA/TIA患者組(疾病組)的腸道菌群結構則表現(xiàn)出了明顯不同于對照組的腸道菌群結構。其中,α-多樣性分析表明疾病組具有較對照組明顯多樣化的腸道菌群�；谖醇訖嗟腢niFrac距離分析,我們發(fā)現(xiàn)相比于Non-AS和IMT組,對照組AS亞組的腸道菌群結構已經表現(xiàn)出了傾向于類似LAA/TIA患者腸道菌群失衡改變的趨勢。這個結果說明,對照組AS亞組的腸道菌群結構已經出現(xiàn)了輕度的紊亂表現(xiàn),且這種紊亂與疾病組相似。另外,LEfSe分析表明,疾病組患者腸道菌群含有更多的機會致病菌(有害菌),如腸桿菌屬、巨型球菌屬、脫硫弧菌屬等,而被廣泛認可的有益菌如擬桿菌屬、普氏菌屬和柔嫩梭菌屬含量明顯下降。且這種菌群紊亂的改變在卒中較為嚴重的患者中更加明顯。與此同時,通過檢測兩組人群的血漿TMAO水平,我們發(fā)現(xiàn),與預期的結果相反,LAA/TIA患者血漿TMAO水平非但沒有出現(xiàn)升高,反而出現(xiàn)了較對照組顯著下降的現(xiàn)象(P0.05)。結論LAA/TIA患者與對照組相比出現(xiàn)了明顯的腸道菌群紊亂的表現(xiàn),其腸道菌群有害菌比例升高,而有益菌含量較對照組明顯降低；且疾病組血漿TMAO水平明顯低于對照組。
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3

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本文編號：1221959