本文關(guān)鍵詞：局部低劑量X線輻照對(duì)BMSCs向周?chē)窠?jīng)損傷部位歸巢影響的實(shí)驗(yàn)研究

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【摘要】：第一部分:大鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)、鑒定及染色目的:掌握骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)、鑒定及染色的方法,并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行初步分析。方法:大鼠處死消毒后,無(wú)菌操作取出大鼠雙側(cè)股骨、脛骨,暴露骨髓腔,用L-DMEM反復(fù)沖洗骨髓腔,收集細(xì)胞懸液,離心,棄上清,重懸后計(jì)數(shù),接種于的細(xì)胞培養(yǎng)瓶?jī)?nèi),置于37℃、飽和濕度、5%C02條件下培養(yǎng),應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合差速貼壁法進(jìn)行細(xì)胞分離純化。待細(xì)胞達(dá)85%-90%融合時(shí),胰酶消化傳代,倒置相差顯微鏡下觀察各代細(xì)胞的生長(zhǎng)及形態(tài)變化。應(yīng)用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面標(biāo)識(shí)進(jìn)行鑒定。細(xì)胞計(jì)數(shù)法觀察并測(cè)繪細(xì)胞生長(zhǎng)曲線圖。使用CFDA SE染料對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染色標(biāo)記。結(jié)果:原代細(xì)胞接種培養(yǎng)后2h后,可觀察到部分細(xì)胞開(kāi)始貼壁,多呈圓形,折光性較強(qiáng)。1天后可見(jiàn)貼壁細(xì)胞增多,常呈圓形、橢圓形,少量梭形。3天后貼壁細(xì)胞逐漸呈長(zhǎng)梭形、三角或多邊形,多形成5-10個(gè)細(xì)胞的簇狀細(xì)胞團(tuán)。2-4天后細(xì)胞呈克隆樣生長(zhǎng),增殖緩慢,細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于梭形、長(zhǎng)梭形,也有少量圓形細(xì)胞及多角形細(xì)胞。第5-8天時(shí)細(xì)胞克隆樣生長(zhǎng)快速,簇狀細(xì)胞集落迅速增多,并向周?chē)粩鄶U(kuò)大。原代培養(yǎng)第10-14天細(xì)胞集落可達(dá)85%-90%融合,通常表現(xiàn)為魚(yú)群狀、旋渦狀,即可傳代。P2、P4、P6代細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖曲線相接近。取生長(zhǎng)狀態(tài)均一良好的P4代BMSCs,應(yīng)用流式細(xì)胞法進(jìn)行BMSCs表面抗原標(biāo)志物鑒定結(jié)果為:CD34(0.8%)、CD45(1.3%)陰性;CD29(93.7%)、CD90(99.8%)陽(yáng)性。結(jié)論:應(yīng)用全骨髓培養(yǎng)結(jié)合差速貼壁法能在體外簡(jiǎn)單、快速的分離和純化大鼠BMSCs,且增殖迅速、性狀穩(wěn)定。第二部分局部低劑量X線輻照對(duì)BMSCs向周?chē)窠?jīng)損傷部位歸巢影響的實(shí)驗(yàn)研究目的:設(shè)計(jì)在小間隙吻合法修復(fù)周?chē)窠?jīng)損傷的基礎(chǔ)上,結(jié)合局部低劑量X線輻照,通過(guò)大鼠尾靜脈移植BMSCs,觀察低劑量X線輻照對(duì)BMSCs向周?chē)窠?jīng)損傷部位歸巢的影響,并探討其可能的機(jī)制。方法:采用健康清潔級(jí)2月齡雄性SD大鼠60只,體重250-300g,經(jīng)小間隙吻合法制成周?chē)窠?jīng)損傷修復(fù)模型后,隨機(jī)均分為2組,實(shí)驗(yàn)組于術(shù)后24h行局部1 Gy的X輻照,對(duì)照組不予以照射;低劑量輻照干預(yù)后1小時(shí),兩組大鼠均經(jīng)尾靜脈移植BMSCs。分別于BMSCs移植后24h、48h、96h每組每個(gè)時(shí)間點(diǎn)各選取6只大鼠,制作冰凍切片,熒光顯微鏡觀察比較兩組的BMSCs歸巢差異。并通過(guò)大鼠一般狀態(tài)、光鏡下神經(jīng)大體形態(tài)、坐骨神經(jīng)指數(shù)、運(yùn)動(dòng)神經(jīng)傳導(dǎo)速度、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)、神經(jīng)透射電鏡的超微結(jié)構(gòu)觀察比較兩組大鼠神經(jīng)功能的恢復(fù)情況。結(jié)果:1、各時(shí)段大鼠坐骨神經(jīng)冰凍切片后熒光顯微鏡下對(duì)比觀察BMSCs歸巢數(shù)結(jié)果:實(shí)驗(yàn)組:24h(+++);48h(++);96h(++)。對(duì)照組:24h(++);48h(+);96h(-)。低劑量X線輻照干預(yù)后的實(shí)驗(yàn)組的BMSCs歸巢數(shù)明顯多于對(duì)照組,且表現(xiàn)為細(xì)胞移植后24h歸巢數(shù)最多,隨后下降。2、大體觀察:(1)兩組大鼠均在術(shù)后出現(xiàn)患肢癱瘓,各足趾并攏,不能主動(dòng)展開(kāi),踝及足趾下垂致使足背或趾尖觸地拖行。實(shí)驗(yàn)組大鼠術(shù)后均未出現(xiàn)足部潰瘍及自噬現(xiàn)象。而對(duì)照組大鼠術(shù)后2周有4只出現(xiàn)足跟部潰瘍,至第4周潰瘍完全愈合,無(wú)肢體自噬現(xiàn)象。(2)患肢自主活動(dòng)恢復(fù)情況:實(shí)驗(yàn)組術(shù)后3周開(kāi)始患肢自主活動(dòng),對(duì)照組術(shù)后5周開(kāi)始恢復(fù)自主活動(dòng)。3、顯微鏡下神經(jīng)吻合口形態(tài)觀察:實(shí)驗(yàn)組中神經(jīng)損傷處與周?chē)M織粘連明顯輕于對(duì)照組,且直徑與正常神經(jīng)干無(wú)明顯差異;而對(duì)照組神經(jīng)直徑較正常神經(jīng)干稍細(xì),且吻合口處表面可見(jiàn)的新生毛細(xì)血管明顯少于實(shí)驗(yàn)組。4、坐骨神經(jīng)功能指數(shù)(SFI):兩組大鼠SFI都表現(xiàn)為逐漸恢復(fù),術(shù)后4周、8周、12周各時(shí)間段實(shí)驗(yàn)組SFI恢復(fù)均優(yōu)于對(duì)照組,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。5、組織學(xué)和免疫組織化學(xué)觀察:(1)HE染色:實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組均可見(jiàn)神經(jīng)纖維通過(guò)小間隙到達(dá)遠(yuǎn)端。實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維排列、單位面積再生神經(jīng)纖維密度、軸突腫脹程度等情況均優(yōu)于對(duì)照組。(2)免疫組織化學(xué):實(shí)驗(yàn)組抗S-100(+++),對(duì)照組抗S-100(++)。實(shí)驗(yàn)組雪旺氏細(xì)胞增生明顯,雪旺氏細(xì)胞數(shù)目較多。而對(duì)照組相對(duì)較少。6、神經(jīng)電生理檢測(cè):兩組大鼠坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度都有不同程度的恢復(fù),實(shí)驗(yàn)組在6周、12周時(shí)坐骨神經(jīng)傳導(dǎo)速度及波幅均高于對(duì)照組,差異有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。7、透射電鏡觀察:每高倍顯微鏡視野下實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)纖維數(shù)量、軸突直徑、髓鞘形態(tài)、神經(jīng)纖維形態(tài)結(jié)構(gòu)均優(yōu)于對(duì)照組。結(jié)論:通過(guò)尾靜脈移植的BMSCs能夠歸巢至周?chē)窠?jīng)損傷部位;同時(shí),通過(guò)局部低劑量X線輻照干預(yù)可明顯促進(jìn)BMSCs向周?chē)窠?jīng)損傷部位歸巢,從而起到促進(jìn)神經(jīng)的再生和功能的恢復(fù),但其明確機(jī)制還有待進(jìn)一步研究探討。
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R745

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 吳堅(jiān);劉炎;王潔;姚健;顧曉松;;自體骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞組織工程化神經(jīng)修復(fù)坐骨神經(jīng)缺損的研究[J];交通醫(yī)學(xué);2006年06期

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本文編號(hào)：1205550