本文關(guān)鍵詞：P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用及機(jī)制研究

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【摘要】：目的:1.通過(guò)離體培養(yǎng)大鼠星形膠質(zhì)細(xì)胞,觀察P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用,包括細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察和對(duì)IL-1β和IL-10釋放量的檢測(cè)。2.通過(guò)P物質(zhì)作用于離體培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞,觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞胞內(nèi)Ca2+濃度的變化,探討活化可能的機(jī)制。方法:1.取出生24 h以內(nèi)的SD乳鼠原代培養(yǎng)星形膠質(zhì)細(xì)胞。將培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞分為5組:(1)對(duì)照組,細(xì)胞孵育全培液;(2)全培液+P物質(zhì)30 n M組;(3)全培液+P物質(zhì)100 n M組;(4)全培液+P物質(zhì)300 n M組;(5)全培液+P物質(zhì)1000 n M組。各組細(xì)胞分別在孵育2 h、6 h、12 h、24 h后收集細(xì)胞上清液同時(shí)保留細(xì)胞,以便進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。2.采用免疫細(xì)胞熒光法鑒定GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞,并觀察P物質(zhì)孵育后星形膠質(zhì)細(xì)胞在各濃度以及各時(shí)間點(diǎn)的形態(tài)變化。3.采用ELISA的方法檢測(cè)P物質(zhì)孵育后星形膠質(zhì)細(xì)胞在各濃度及各時(shí)間點(diǎn)釋放IL-1β和IL-10的情況。4.利用比例高內(nèi)涵成像系統(tǒng)的胞內(nèi)鈣離子成像技術(shù)觀察P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后,其胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。結(jié)果:1.培養(yǎng)的星形膠質(zhì)細(xì)胞的鑒定:經(jīng)免疫細(xì)胞熒光法鑒定,培養(yǎng)的細(xì)胞為GFAP陽(yáng)性的星形膠質(zhì)細(xì)胞。用DAPI復(fù)染后,證實(shí)細(xì)胞的純度達(dá)95%以上。2.P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的形態(tài)學(xué)改變:以細(xì)胞孵育全培液作為對(duì)照組。30 n M的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h、12 h、24 h分別與之比較,其形態(tài)幾乎無(wú)變化。100 n M的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的6 h,部分細(xì)胞的胞體開始變大變圓,突起回縮,呈現(xiàn)出活化的形態(tài)學(xué)表現(xiàn),且隨著時(shí)間的延長(zhǎng),至12 h發(fā)生這種形態(tài)變化的細(xì)胞數(shù)目逐漸增多,GFAP的免疫染色也增強(qiáng)。300 n M的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后的6 h、12 h,呈現(xiàn)活化態(tài)的細(xì)胞數(shù)目均較100 n M組增加,此外GFAP的免疫染色也較100 n M組增強(qiáng)。1000 n M的P物質(zhì)孵育星形膠質(zhì)細(xì)胞后2 h,細(xì)胞形態(tài)開始出現(xiàn)上述變化,但至6 h、12 h時(shí)GFAP的免疫染色均低于100 n M、300 n M組。100 n M、300 n M組的星形膠質(zhì)細(xì)胞在孵育至24 h時(shí)GFAP的免疫染色均較12 h時(shí)減弱。3.IL-1β的檢測(cè)結(jié)果:以細(xì)胞孵育全培液組的細(xì)胞上清液作為對(duì)照組。30 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h、24 h,細(xì)胞上清液中的IL-1β含量與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,而12 h細(xì)胞上清液中的IL-1β含量高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100 n M、300 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h、12 h,細(xì)胞上清液中的IL-1β含量較對(duì)照組增加,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而24 h細(xì)胞上清液中的IL-1β含量與對(duì)照組相比,差異不再有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后,促進(jìn)其釋放IL-1β,而且具有特定的時(shí)間過(guò)程。30 n M的P物質(zhì)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β的作用在12 h最明顯,至24 h該作用消失。100 n M、300 n M的P物質(zhì)促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-1β的作用在2 h開始,在6h作用最強(qiáng),之后隨著時(shí)間的延長(zhǎng),該作用逐漸減弱,至24 h該作用幾乎消失。4.IL-10的檢測(cè)結(jié)果:以細(xì)胞孵育全培液組的細(xì)胞上清液作為對(duì)照組。30 n M、100 n M、300 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的2 h、6 h,細(xì)胞上清液中的IL-10含量與對(duì)照組相比均減少,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30 n M、100 n M、300 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的12 h,細(xì)胞上清液中的IL-10含量與對(duì)照組相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。30 n M、100 n M、300 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后的24 h,細(xì)胞上清液中的IL-10含量與對(duì)照組相比增加,且差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。說(shuō)明P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞的最初2 h和6 h內(nèi),抑制其釋放IL-10。然而隨著時(shí)間的延長(zhǎng),P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放IL-10的抑制作用逐漸減弱。5.胞內(nèi)鈣離子成像結(jié)果:以細(xì)胞孵育Hanks液作為對(duì)照組,60 m M的kcl用于檢測(cè)星形膠質(zhì)細(xì)胞的功能活性。30 n M、100 n M、300 n M、1000 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后,其胞內(nèi)鈣離子的濃度與對(duì)照組相比均增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。100 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后,其胞內(nèi)鈣離子的濃度高于30n M、300 n M、1000 n M的P物質(zhì)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。300 n M的P物質(zhì)作用后,星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度高于30 n M、1000 n M的P物質(zhì)組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。而1000 n M的P物質(zhì)作用后,星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)鈣離子的濃度與30 n M的P物質(zhì)相比,差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以上說(shuō)明,P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后,其胞內(nèi)鈣離子的濃度升高。其中,以100 n M的P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后引起的胞內(nèi)鈣離子濃度的升高最為顯著。結(jié)論:1.P物質(zhì)能夠誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞呈現(xiàn)出活化態(tài)形態(tài)改變。2.P物質(zhì)能夠促進(jìn)星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放促炎因子IL-1β,抑制星形膠質(zhì)細(xì)胞釋放抗炎因子IL-10。3.P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用可持續(xù)約12 h,至24 h時(shí)該作用減弱甚至消失。4.P物質(zhì)作用于星形膠質(zhì)細(xì)胞后,其胞內(nèi)鈣離子的濃度升高。100 n M P物質(zhì)的作用最強(qiáng)。5.P物質(zhì)誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞活化參與疼痛的形成,可能與鈣離子信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑的激活以及促進(jìn)其釋放IL-1β并抑制其釋放IL-10有關(guān)。慢性神經(jīng)病理性疼痛是由軀體感覺神經(jīng)系統(tǒng)的損傷造成的,其主要表現(xiàn)為異常的痛感受,包括觸誘發(fā)痛(正常非傷害性刺激引起的疼痛)和痛覺過(guò)敏(對(duì)傷害性刺激過(guò)度的痛反應(yīng))。慢性疼痛可以持續(xù)數(shù)月,給病人帶來(lái)極大痛苦,而臨床上也缺乏有效的治療手段。以往痛覺幾十年的研究取得了巨大的成就,對(duì)痛覺的中樞區(qū)域、不同中樞的功能作用及相互聯(lián)系、局部的神經(jīng)環(huán)路、痛覺感受器的感受機(jī)制、參與痛覺傳遞的神經(jīng)化學(xué)物質(zhì)等有了深入了解。但既往的研究主要關(guān)注神經(jīng)元、神經(jīng)元構(gòu)成的環(huán)路及神經(jīng)遞質(zhì)的作用。而且基于上述研究結(jié)果設(shè)計(jì)的藥物也是以參與痛覺傳遞的神經(jīng)元為靶標(biāo),雖有一定療效但對(duì)慢性疼痛的治療效果并不理想。近些年神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在痛信號(hào)產(chǎn)生、傳遞、痛覺形成中的重要作用被逐漸予以重視,已經(jīng)成為痛覺研究及治療的重要靶點(diǎn)。在神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi),神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的數(shù)目遠(yuǎn)多于神經(jīng)元,越來(lái)越多的資料顯示膠質(zhì)細(xì)胞在神經(jīng)生理及病理?xiàng)l件下的功能作用非常重要。研究發(fā)現(xiàn)疼痛模型的動(dòng)物在慢性疼痛發(fā)生時(shí)伴隨有脊髓內(nèi)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化,表現(xiàn)為胞體肥大,樹突回縮,表面標(biāo)記蛋白表達(dá)增多等現(xiàn)象。鞘內(nèi)或者全身應(yīng)用神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞代謝抑制劑后,膠質(zhì)細(xì)胞活化減弱,同時(shí)慢性疼痛癥狀也得到緩解。這些結(jié)果均提示,慢性疼痛的形成與脊髓神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的活化相關(guān)。但由于神經(jīng)系統(tǒng)是由神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞構(gòu)成的復(fù)雜環(huán)路,常規(guī)的疼痛研究模型無(wú)法對(duì)神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞進(jìn)行深入、系統(tǒng)的觀察,其研究結(jié)論也難以排除神經(jīng)元的影響。因此神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞在疼痛信號(hào)產(chǎn)生、傳遞過(guò)程的作用及機(jī)制,如膠質(zhì)細(xì)胞如何活化,活化后如何發(fā)揮作用等并不明確。研究表明,痛模型的大鼠在損傷部位應(yīng)用局部麻醉藥利多卡因之后脊髓內(nèi)GFAP的表達(dá)減少,而GFAP是星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異標(biāo)記蛋白,這些結(jié)果表明,傷害性刺激通過(guò)神經(jīng)元繼而引起中樞神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的激活。提示經(jīng)神經(jīng)元向脊髓傳遞的傷害性信號(hào)可能是星形膠質(zhì)細(xì)胞活化的啟動(dòng)因素。外周感覺神經(jīng)元向脊髓傳遞感覺信號(hào)的物質(zhì)基礎(chǔ)是神經(jīng)遞質(zhì),P物質(zhì)屬于速激肽家族,是脊髓水平傳遞痛信號(hào)特異的神經(jīng)遞質(zhì)。NK1受體是P物質(zhì)的特異性受體,研究發(fā)現(xiàn)NK1受體在神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞也有分布。常規(guī)在體實(shí)驗(yàn)結(jié)果是基于神經(jīng)元和膠質(zhì)細(xì)胞網(wǎng)絡(luò)所獲得的,這種方式無(wú)法明確P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的直接效應(yīng),即P物質(zhì)是否會(huì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生直接刺激使其激活、激活的途徑是什么,如是否會(huì)通過(guò)星形膠質(zhì)細(xì)胞合成、釋放細(xì)胞因子(包括炎性因子和促炎因子)參與疼痛的傳遞和調(diào)節(jié)。因此本研究將采用離體實(shí)驗(yàn)觀察痛特異的神經(jīng)遞質(zhì)P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用及相關(guān)機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：山西醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 龔佩佩;磷酸化MSK1在星形膠質(zhì)細(xì)胞炎癥活化過(guò)程中的作用的研究[D];南通大學(xué);2013年

2 何潔玉;糖皮質(zhì)激素對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞分泌GnRH的調(diào)控機(jī)制[D];西南大學(xué);2015年

3 張麗麗;脂肪基質(zhì)細(xì)胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過(guò)程中線粒體凋亡與自噬的關(guān)系[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

4 燕茹;高同型半胱氨酸血癥致ApoE~(-/-)小鼠腦血管、星形膠質(zhì)細(xì)胞及神經(jīng)元損傷作用研究[D];寧夏醫(yī)科大學(xué);2015年

5 高亞榮;NB-3介導(dǎo)神經(jīng)軸突接觸性抑制的信號(hào)傳導(dǎo)機(jī)制的體外培養(yǎng)研究[D];蘇州大學(xué);2015年

6 米鵬霞;P物質(zhì)對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞的活化作用及機(jī)制研究[D];山西醫(yī)科大學(xué);2015年

7 楊志奇;小鼠皮層內(nèi)移植膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)及功能重建研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

8 陳雅南;敲除星形膠質(zhì)細(xì)胞的dicer對(duì)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的影響[D];杭州師范大學(xué);2015年

9 馬輝;星形膠質(zhì)細(xì)胞上酸敏感離子通道1a在顳葉癲癇發(fā)生中的作用研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2015年

10 張媛;飛秒脈沖激光誘導(dǎo)的星形膠質(zhì)細(xì)胞鈣波[D];華中科技大學(xué);2007年

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本文編號(hào)：1151825