本文關(guān)鍵詞：CaBP4基因突變在常染色體顯性遺傳夜發(fā)性額葉癲癇中的電生理功能研究

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【摘要】：癲癇是最常見的慢性腦部疾病之一,是由多種因素引起大腦神經(jīng)元異常同步放電,導(dǎo)致反復(fù)的發(fā)作性和短暫性的中樞神經(jīng)系統(tǒng)功能異常。世界衛(wèi)生組織(World Health Organization, WHO)估計全世界癲癇患者總數(shù)約為7000萬人。據(jù)不完全統(tǒng)計,目前我國癲癇患者人數(shù)約900萬,癲癇患病率可高達(dá)4‰-7‰,其中2/3為兒童癲癇患者。反復(fù)癲癇發(fā)作可加重中樞神經(jīng)系統(tǒng)的損傷,影響患者的認(rèn)知、智力、發(fā)育及生活質(zhì)量等方面,甚至可致殘或危及生命。目前癲癇的發(fā)病機制仍不清楚。近年來研究表明,遺傳因素是癲癇的主要病因之一,其在特發(fā)性癲癇的發(fā)生中尤為顯著。研究已發(fā)現(xiàn)高達(dá)一千多種的基因突變能夠引起癲癇發(fā)作,其中約有150種癲癇表現(xiàn)為單基因遺傳性疾病。這些孟德爾遺傳方式的癲癇主要是離子通道病,大多數(shù)為編碼電壓門控性離子通道和配體門控性離子通道的基因突變所引起的,且基因型與臨床表型表現(xiàn)為同質(zhì)性。常染色體顯性遺傳夜間發(fā)作性額葉癲癇(autosomal dominant nocturnal frontal epilepsy,ADNFLE)是第一個明確致病基因的單基因遺傳局灶性癲癇綜合征,是以叢集性、頻繁的、短暫的(數(shù)秒～數(shù)分鐘)夜間運動性發(fā)作為特征,發(fā)作可表現(xiàn)為肌張力障礙(或)強直以及過度運動。大量的研究發(fā)現(xiàn),約有12%的ADNFLE家系存在編碼神經(jīng)元煙堿型乙酰膽堿受體(nAChRs)亞基的基因突變。迄今為止,已發(fā)現(xiàn)了nAChRs的三個位點與ADNFLE相關(guān),分別為ENFL1、ENFL3和ENFL4。ENFL1位于染色體20q13,該區(qū)域中CHRNA4基因編碼產(chǎn)物是乙酰膽堿受體α 4亞基。目前CHRNA4基因有5個基因突變被證實可引起ADNFLE,其中4個為錯義突變(S248F, S252L, T265I和R308H),1個為插入突變(259InsL)。并且,CHRNA4基因突變在不同家系中表現(xiàn)出遺傳異質(zhì)性,這與其常染體顯性遺傳方式相符。ENFL3位于染色體1q21,該區(qū)域內(nèi)包含了編碼AChRs的β 2亞基基因(CHRNB2基因),目前己發(fā)現(xiàn)了6個CHRNB2基因突變,均為錯義突變,分別為V287L、V287M、 L301V、V308A、I312M和V337G。ENFL4位于染色體8p21,2006年有學(xué)者發(fā)現(xiàn)了該區(qū)域內(nèi)編碼nAChRs的α 2亞基基因CHRNA2—個新雜合錯義突變1279N。然而,CHRNA4、CHRNA2和CHRNB2基因突變僅覆蓋小部分的ADNFLE家系,提示可能存在其他ADNFLE致病基因。研究學(xué)者相繼還發(fā)現(xiàn)了ADNFLE其他可能的致病基因,分別為促腎上腺皮質(zhì)素釋放激素(CRH)基因、編碼鈉門控鉀離子通道KCNT1基因以及DEPDC5基因。ADNFLE基因突變相關(guān)的功能研究發(fā)現(xiàn),ADNFLE基因突變可導(dǎo)致受體功能的增強和減弱鈣離子誘導(dǎo)的乙酰膽堿受體應(yīng)答。細(xì)胞外的鈣離子對神經(jīng)元nAChR有雙重作用。當(dāng)胞外鈣離子濃度在1～8微摩爾范圍,胞外鈣離子可增強乙酰膽堿反應(yīng)；當(dāng)胞外鈣離子濃度在10～20微摩爾范圍,它可阻滯α 4 β 2亞基與乙酰膽堿反應(yīng)。突觸前煙堿型乙酰膽堿受體能夠同時促進興奮性神經(jīng)遞質(zhì)和抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,具有負(fù)反饋調(diào)節(jié)作用的鈣調(diào)控作用可阻止中樞神經(jīng)元系統(tǒng)興奮性神經(jīng)元的突觸前膜在反復(fù)同步放電的過程中過度釋放興奮性神經(jīng)遞質(zhì)谷氨酸。但ADNFLE基因突變可使鈣離子調(diào)控作用的負(fù)反饋機制失調(diào),促進興奮性神經(jīng)元遞質(zhì)和減少抑制性神經(jīng)遞質(zhì)的釋放,使神經(jīng)元的興奮性升高,導(dǎo)致ADNFLE發(fā)生。還有研究發(fā)現(xiàn),部分ADNFLE基因突變位于阻滯介導(dǎo)肌肉煙堿型乙酰膽堿受體的開放通道的位置上,鈣離子可通過結(jié)合通道孔或其鄰近位置而阻滯α 4β 2亞基nAChR應(yīng)答。以上實驗結(jié)果提示,鈣離子在ADNFLE致病機制中起著重要作用。在前期工作中,我們應(yīng)用全基因組外顯子測序技術(shù)及Sanger直接測序法在一個ADNFLE家系中發(fā)現(xiàn)了一個CaBP4基因新錯義突變即CaBP4基因p.G155D突變,本家系和其他家系內(nèi)及200名對照健康人群驗證均未發(fā)現(xiàn)此基因突變。CaBP4基因定位于染色體1lql3.2,全長828bp,含有6個外顯子編碼區(qū),編碼產(chǎn)物為含有275個氨基酸的鈣連接蛋白4。鈣連接蛋白4(Ca2+-bingding protein 4,CaBP4)是一種特性類似于鈣調(diào)節(jié)蛋白的神經(jīng)元鈣連接蛋白,可參與細(xì)胞L型電壓門控性鈣通道的調(diào)節(jié)和神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。目前研究發(fā)現(xiàn),CaBP4基因突變可延緩鈣通道的失活導(dǎo)致鈣離子內(nèi)流增多,或減弱鈣離子的親和力或結(jié)合能力致鈣離子外流減少,也可影響自身蛋白結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性、與其他蛋白的相互作用的信號通路或神經(jīng)遞質(zhì)的釋放。但CaBP4基因突變尚未在癲癇有所報道。結(jié)合生物信息學(xué)分析結(jié)果,我們推CaBP4基因p.G155D突變可能引起ADNFLE發(fā)病,其作用機制可能是CaBP4新錯義突變(p.G155D)改變了CaBP4蛋白的正常結(jié)構(gòu),突變后的CaBP4蛋白對鈣通道的調(diào)節(jié)異常,引起神經(jīng)元胞內(nèi)外的鈣離子自我穩(wěn)態(tài)失衡,使神經(jīng)元產(chǎn)生異常同步化放電而致癲癇發(fā)生。本研究擬應(yīng)用膜片鉗技術(shù)檢測CaBP4基因p. G155D突變對海馬錐體細(xì)胞膜電位的改變情況,明確CaBP4基因p.G155D突變在ADNFLE發(fā)病機制的電生理功能。[方法](1)構(gòu)建突變型CaBP4基因重組質(zhì)粒(pEGFP-N1-CaBP4mu)和野生型CaBP4基因重組質(zhì)粒(pEGFP-N1-CaBP4wt),取其甘油菌進行質(zhì)粒擴增及提取,應(yīng)用質(zhì)粒酶切產(chǎn)物進行瓊脂糖凝膠電泳實驗初步鑒定構(gòu)建的突變型及野生型CaBP4基因重組質(zhì)粒是否成功,并進一步行基因測序進行驗證；(2)取生后0～24小時的SD大鼠的大腦海馬,采用胰酶及吹打聯(lián)合消化方法將其消化成單個散在細(xì)胞,進行細(xì)胞計數(shù)并按照700000/孔密度種植,應(yīng)用無血清培養(yǎng)基進行原代海馬神經(jīng)元培養(yǎng),培養(yǎng)至第6～7天后采用免疫熒光方法檢測原代海馬神經(jīng)元的純度,并進行統(tǒng)計分析；(3)采用X-tremeGENE將構(gòu)建的pEGFP-N1-CaBP4mu質(zhì)粒和pEGFP-N1-CaBP4wt質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至原代海馬神經(jīng)元,可分為實驗組(轉(zhuǎn)染突變型CaBP4基因重組質(zhì)粒的海馬神經(jīng)元)和對照組(轉(zhuǎn)染野生型CaBP4基因重組質(zhì)粒的海馬神經(jīng)元),轉(zhuǎn)染后72小時后應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染后綠色熒光表達(dá)的情況及計算轉(zhuǎn)染效率；(4)應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)分別記錄實驗組和對照組有綠色熒光表達(dá)的轉(zhuǎn)染后海馬神經(jīng)元的L型鈣通道電流以及動作電位發(fā)放頻率情況。[結(jié)果](1)原代培養(yǎng)的海馬神經(jīng)元在培養(yǎng)第1天大多數(shù)細(xì)胞貼壁良好并伸出突起,胞體增大,呈橢圓形或錐體形；培養(yǎng)至第3天時,海馬神經(jīng)細(xì)胞以多個突起的錐體細(xì)胞為主,周邊有光暈,神經(jīng)元突起明顯增多并伸長,相鄰細(xì)胞間形成稀疏的網(wǎng)絡(luò)：培養(yǎng)至第5天時,胞體進一步增大,突起明顯增長,神經(jīng)元之間形成稠密的網(wǎng)絡(luò)；培養(yǎng)至第7天,神經(jīng)元細(xì)胞已生長的比較成熟,周邊光暈明顯,細(xì)胞呈集中分布趨勢,免疫熒光方法檢測海馬神經(jīng)元的純度為83.69%±3.55%。(2)應(yīng)用XhoⅠ和HindⅢ限制性內(nèi)切酶對突變型CaBP4基因重組質(zhì)粒(pEGFP-N1- CaBP4mu)和野生型CaBP4基因重組質(zhì)粒(pEGFP-N1- CaBP4wt)進行酶切,酶切產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳實驗結(jié)果顯示有約為4.72kb和840 bp兩個條帶,初步鑒定突變型和野生型CaBP4基因重組質(zhì)粒構(gòu)建成功,進一步運用基因測序法驗證了構(gòu)建的CaBP4基因重組質(zhì)�；蛐蛄信c設(shè)計序列一致。(3)將突變型和野生型的CaBP4重組質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染培養(yǎng)了3天的原代海馬神經(jīng)元,分為實驗組(轉(zhuǎn)染突變型CaBP4重組質(zhì)粒的海馬神經(jīng)元)和對照組(轉(zhuǎn)染野生型CaBP4重組質(zhì)粒的海馬神經(jīng)元),應(yīng)用倒置熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染72小時后實驗組和對照組的海馬神經(jīng)元綠色熒光表達(dá)情況,實驗組的轉(zhuǎn)染效率為11.88%±2.44%,對照組的轉(zhuǎn)染效率為12.09%±2.09%,且實驗組的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)死亡的數(shù)量比對照組的要多。(4)應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)分別對實驗組和對照組轉(zhuǎn)染72小時后且有綠色熒光表達(dá)的海馬神經(jīng)元進行檢測L型鈣電流情況,在給予海馬神經(jīng)元相同的步階刺激后,實驗組的L型鈣電流比對照組的增大。從兩組的I-V曲線可見,兩組的海馬神經(jīng)元的L型鈣通道約在電壓-40mV時開放,當(dāng)電壓達(dá)到10mV左右時通道電流達(dá)到峰值,實驗組的海馬神經(jīng)元的L型鈣電流峰值為-13.15±4.35pA(n=5),對照組的海馬神經(jīng)元的L型鈣電流峰值為-7.67±5.11 pA(n=6),且實驗組的I-V曲線較對照組向超極化的方向下移。(5)應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)分別對實驗組和對照組轉(zhuǎn)染72小時后且有綠色熒光表達(dá)的海馬神經(jīng)元進行動作電位的檢測,發(fā)現(xiàn)在相同的階躍刺激下實驗組的海馬神經(jīng)元動作電位的發(fā)放頻率較對照組的顯著增加。[結(jié)論](1)應(yīng)用膜片鉗全細(xì)胞記錄技術(shù)首次研究CaBP4基因p.G155D突變在常染色體顯性遺傳夜間發(fā)作性額葉癲癇發(fā)病機制中的電生理功能。(2)轉(zhuǎn)染突變型CaBP4重組質(zhì)粒海馬神經(jīng)元的L型鈣電流較對照組內(nèi)流增多,且動作電位發(fā)放頻率顯著增加。實驗結(jié)果提示CaBP4基因p.G155D突變可能通過改變CaBP4蛋白結(jié)構(gòu)或功能,影響海馬神經(jīng)元的L-型鈣通道對鈣離子的調(diào)控作用,引起細(xì)胞外的鈣離子內(nèi)流增多,進一步觸發(fā)突觸終末神經(jīng)遞質(zhì)釋放增加,從而增強海馬神經(jīng)元的興奮性,導(dǎo)致癲癇發(fā)作。(3)實驗組的海馬神經(jīng)元出現(xiàn)死亡的數(shù)量較對照組的要多。實驗結(jié)果提示CaBP4基因p.G155D突變可能通過增加細(xì)胞外鈣離子內(nèi)流而導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)鈣超載,從而對神經(jīng)元產(chǎn)生神經(jīng)元毒性,加重神經(jīng)元的損傷及促進其死亡
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R742.1

【共引文獻】

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本文編號：1146553