本文關(guān)鍵詞：GM-CSF對(duì)替莫唑胺抗高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的作用

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【摘要】：研究背景高級(jí)別膠質(zhì)瘤是成人最常見的原發(fā)性腦惡性腫瘤,占腦腫瘤的60-70%,目前的標(biāo)準(zhǔn)治療為最大化手術(shù)切除腫瘤后行放化療,替莫唑胺是目前被廣泛接受治療腦膠質(zhì)瘤的化療藥物,主要通過DNA鳥嘌呤的O6和N2位點(diǎn)上的烷基化(甲基化)發(fā)揮細(xì)胞毒作用,腫瘤耐藥現(xiàn)象仍是目前治療高級(jí)別膠質(zhì)瘤的難題之一。與此同時(shí),與放化療相關(guān)的血液系統(tǒng)毒副作用已引起重視,主要表現(xiàn)為骨髓增生異常綜合征、白血病以及嚴(yán)重骨髓抑制,粒-巨噬細(xì)胞集落刺激因子(granulocyte-macrophage colony-stimulating factor,GM-CSF)是造血生長(zhǎng)因子家族的成員之一,常被用來(lái)治療惡性腫瘤患者化療所致的的白細(xì)胞的數(shù)量和/或功能減退,然而應(yīng)用GM-CSF對(duì)腦膠質(zhì)瘤患者化療的影響如何仍不可知。研究目的擬應(yīng)用GM-CSF對(duì)高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),從而研究TMZ對(duì)GM-CSF干預(yù)后的高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷性并探索其可能的機(jī)制。材料與方法1.高級(jí)別膠質(zhì)瘤患者資料收集2013年9至2015年8月收集在河南省人民醫(yī)院神經(jīng)外科三病區(qū)接受手術(shù)治療的原發(fā)性高級(jí)別腦膠質(zhì)瘤患者41例,腫瘤組織均行常規(guī)病理檢查、免疫組化檢測(cè)MGMT表達(dá)、MGMT啟動(dòng)子甲基化并進(jìn)行膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng),患者及家屬均簽署知情同意書。2.高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的選取和gm-csfr的檢測(cè)根據(jù)病理結(jié)果、mgmt表達(dá)水平、基因啟動(dòng)子甲基化狀態(tài)以及細(xì)胞培養(yǎng)結(jié)果,選6例高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn),細(xì)胞融合度達(dá)90%時(shí)進(jìn)行傳代,傳至第3-4代細(xì)胞穩(wěn)定后采用免疫熒光法檢測(cè)gm-csfr在細(xì)胞中的表達(dá)。3.時(shí)間-細(xì)胞存活率分析設(shè)置tmz組、tmz+gm-csf組和調(diào)零組(培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜),gm-csf和tmz終濃度分別為50ng/ml和100μmol/l。培養(yǎng)24h、48h、72h、96h后分別檢測(cè)細(xì)胞的存活率,篩選出最佳的培養(yǎng)時(shí)間。4.mtt法檢測(cè)細(xì)胞活性設(shè)置對(duì)照組、tmz組、gm-csf組、tmz+gm-csf組、調(diào)零組(培養(yǎng)基、mtt、二甲基亞砜),先加入gm-csf進(jìn)行干預(yù),12h后加入tmz使其終濃度分別為50ng/ml和100μmol/l,72h后檢測(cè)各組的細(xì)胞存活率。5.流式檢測(cè)細(xì)胞周期設(shè)置對(duì)照組、gm-csf組,細(xì)胞傳代6h后加入gm-csf使其終濃度為50ng/ml,48h后收集細(xì)胞,流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期。6.流式檢測(cè)細(xì)胞凋亡率設(shè)置對(duì)照組、gm-csf組、tmz組、gm-csf聯(lián)合tmz組,加入gm-csf12h后添加tmz,72h后收集細(xì)胞用凋亡試劑盒處理上機(jī)檢測(cè)。結(jié)果1.高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的培養(yǎng)選取選取的6例細(xì)胞中間變性星形細(xì)胞瘤2例,多形性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤4例;mgmt蛋白表達(dá)陰性3例,陽(yáng)性表達(dá)1例,強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)1例,弱陽(yáng)性表達(dá)1例;mgmt基因啟動(dòng)子甲基化的3例,非甲基化的3例。免疫熒光顯示膠質(zhì)瘤細(xì)胞均有g(shù)m-csfrα的表達(dá)。2.時(shí)間-細(xì)胞存活率tmz組、gm-csf+tmz組均在培養(yǎng)約72小時(shí)后顯示出較低的細(xì)胞存活率,對(duì)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的抑制率達(dá)到最高。3.mtt法細(xì)胞存活率檢測(cè)6例細(xì)胞gm-csf組的細(xì)胞存活率與對(duì)照組相比均有不同程度的增加,tmz組與gm-csf+tmz組的細(xì)胞存活率均比對(duì)照組明顯下降。mgmt基因啟動(dòng)子甲基化的3例細(xì)胞,gm-csf+tmz組的細(xì)胞存活率(67.67±1.16,68.13±1.06,68.42±1.73)比tmz組(90.00±1.73,82.33±1.53,82.67±2.11)顯著降低(p=0.000,p=0.000,p=0.001),mgmt啟動(dòng)子非甲基化的3例細(xì)胞GM-CSF+TMZ組與TMZ組存活率均無(wú)顯著差異(P0.05)。4.流式細(xì)胞周期結(jié)果分析6例細(xì)胞GM-CSF組(35.32±1.69,26.47±4.74,57.33±2.79,33.78±3.42,34.10±2.90,19.41±1.61)的G1期細(xì)胞比例(%)均比對(duì)照組(89.91±4.08,71.24±6.91,81.15±4.07,85.53±1.39,64.42±5.23,66.06±5.97)降低,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);而S期細(xì)胞比例(%)GM-CSF組(55.87±4.07,46.91±4.99,35.28±3.34,35.73±6.05,56.79±2.76,50.78±1.51)較對(duì)照組(2.19±2.26,22.08±2.07,19.13±3.25,14.51±1.38,28.97±3.51,26.51±4.64)顯著增加(P0.05)。5.流式細(xì)胞凋亡結(jié)果分析GM-CSF組與對(duì)照組相比,6例細(xì)胞的GM-CSF組細(xì)胞凋亡率均降低;MGMT啟動(dòng)子甲基化的3例細(xì)胞GM-CSF+TMZ組凋亡率(19.91±1.93,25.33±2.57,32.15±2.85)與單藥TMZ組凋亡率(10.79±0.60,15.15±1.74,22.27±1.89)相比均顯著增加,其差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.000,P=0.000,P=0.007);MGMT啟動(dòng)子非甲基化的3例細(xì)胞GM-CSF+TMZ組與單藥TMZ組細(xì)胞凋亡率無(wú)明顯差異(P0.05)。結(jié)論1.TMZ對(duì)GM-CSF干預(yù)后的高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞抑制率隨時(shí)間變化逐漸增高。2.GM-CSF可增強(qiáng)TMZ對(duì)MGMT基因啟動(dòng)子甲基化的高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷作用,而對(duì)MGMT基因啟動(dòng)子非甲基化高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的效果不明顯。3.GM-CSF可誘導(dǎo)高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的細(xì)胞周期由G1期快速進(jìn)入S期,從而提高TMZ對(duì)高級(jí)別膠質(zhì)瘤細(xì)胞的殺傷性。
【學(xué)位授予單位】：鄭州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.41

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本文編號(hào)：1142019