本文關(guān)鍵詞：死亡受體凋亡通路與脂肪基質(zhì)細(xì)胞分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)的關(guān)系

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【摘要】：目的研究死亡受體途徑介導(dǎo)的凋亡與成人脂肪基質(zhì)細(xì)胞(Adipose-derived stromal cells,ADSC)體外誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞反應(yīng)過程的關(guān)系,以發(fā)現(xiàn)一個(gè)更好的環(huán)境適宜誘導(dǎo)后的星形膠質(zhì)細(xì)胞生長,使它的數(shù)量有所增加,并且存活的周期變長,這對臨床治療具有重要的意義。方法將所得到的成人皮下脂肪組織借閱葉長青以及Zuk等的實(shí)驗(yàn)步驟進(jìn)行操作,對其消化、培養(yǎng)成為脂肪基質(zhì)細(xì)胞,記錄觀察鏡下脂肪基質(zhì)細(xì)胞每天的形態(tài)學(xué)變化。將生長情況較好的傳至第2、3代的脂肪基質(zhì)細(xì)胞,用誘導(dǎo)劑將其在體外進(jìn)行誘導(dǎo)成為星形膠質(zhì)細(xì)胞,在誘導(dǎo)后的細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化的時(shí)間點(diǎn)分組,分為誘導(dǎo)后48h、7d、14d和21d,并記錄其形態(tài)學(xué)變化的特征。定性及定量檢測脂肪基質(zhì)細(xì)胞及誘導(dǎo)分化后的各個(gè)組的星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志蛋白GFAP,以及死亡受體途徑中受體和配體蛋白的表達(dá)情況。應(yīng)用細(xì)胞流式法Annexin/PI雙染來檢測未誘導(dǎo)組及誘導(dǎo)后各個(gè)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞的早期凋亡率,晚期凋亡率和細(xì)胞存活率等。用MTT法檢測各組的星形膠質(zhì)細(xì)胞的生長存活狀態(tài)。記錄得到的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)應(yīng)用Excel 2007數(shù)據(jù)庫儲存整理,用統(tǒng)計(jì)軟件系統(tǒng)SPSS13.0來統(tǒng)計(jì)分析所有的數(shù)據(jù),連續(xù)變量采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差((?)±s)表示,誘導(dǎo)前后各組間的比較采用單因素方差分析。以P0.05(雙側(cè))作為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。結(jié)果分離培養(yǎng)的24h的原代細(xì)胞已經(jīng)完全貼壁生長,在鏡下可以見到形態(tài)多種多樣的細(xì)胞,可呈不規(guī)則形、類圓形、長或短梭形。到第10d時(shí),可見大量形狀趨于一致的長梭形細(xì)胞排列成漩渦狀生長。誘導(dǎo)后第48h時(shí),發(fā)現(xiàn)細(xì)胞的折光性有所增強(qiáng),有一些細(xì)胞的胞體周圍可見伸出細(xì)而長的有分支的突起。在誘導(dǎo)第7d,可以見到細(xì)胞出現(xiàn)星形膠質(zhì)細(xì)胞所具有的典型的形態(tài),如胞體呈圓形或橢圓形,有細(xì)長的突起并出現(xiàn)較多分支交織成網(wǎng)狀。在14d時(shí),細(xì)胞的折光性較7d時(shí)增強(qiáng)但其形態(tài)無明顯變化。到21d時(shí),細(xì)胞的形態(tài)已明顯不如14d,突起變少、變短,細(xì)胞的數(shù)量也明顯減少。用免疫細(xì)胞化學(xué)法對因子進(jìn)行定性檢測的結(jié)果顯示在未誘導(dǎo)的脂肪基質(zhì)細(xì)胞中GFAP未出現(xiàn)陽性表達(dá),而在誘導(dǎo)后的各組中都可以檢測到陽性表達(dá)的細(xì)胞,而且在整個(gè)細(xì)胞體及突起部位都可以見到陽性表達(dá)的顆粒,僅在7d和14d之間其陽性表達(dá)率無明顯差異(P0.05),并且在誘導(dǎo)反應(yīng)的第7d出現(xiàn)高峰期。Fas/FasL、TNFR1/TNFα、DR5/TRAIL、caspase3和caspase8在未誘導(dǎo)的脂肪基質(zhì)細(xì)胞組和誘導(dǎo)后各組均可見細(xì)胞陽性表達(dá),細(xì)胞漿為最主要的陽性表達(dá)部位,以胞核周圍為著,而在突起部位較少見到的陽性表達(dá)。Fas和FasL的細(xì)胞陽性表達(dá)率在7d時(shí)進(jìn)入高峰期,而與14d組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。TNFR1和TNFα的細(xì)胞陽性表達(dá)率隨誘導(dǎo)時(shí)間的延長而逐漸增高,至21d時(shí)達(dá)到高峰期,且各組間之間均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異性(P0.05)。DR5細(xì)胞陽性表達(dá)率在第7d組達(dá)高峰,除48h與21d組其余各組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。TRAIL細(xì)胞陽性表達(dá)率在第7d組達(dá)到高峰期,各組間均有明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Caspase8的細(xì)胞陽性表達(dá)率隨著誘導(dǎo)時(shí)間而逐漸增高,在21d時(shí)達(dá)到最高峰期,除未誘導(dǎo)組和48h其余各組間均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Caspase3的細(xì)胞陽性表達(dá)率在第7d組達(dá)到高峰期,僅21d與48h之間無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Westernblotting結(jié)果顯示GFAP的表達(dá)水平在誘導(dǎo)反應(yīng)的第7d達(dá)到高峰值,僅7d與14d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。Fas和FasL的表達(dá)水平在第7d達(dá)到高峰值,僅7d與14d無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。TNFR1和TNFα的表達(dá)水平隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而逐漸增高且各時(shí)間組間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),在21d組時(shí)達(dá)到高峰值。DR5的表達(dá)水平在第7d時(shí)達(dá)到高峰值且明顯高于14d組(P0.05)。TRAIL的表達(dá)水平在各組間均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異,在第7d組進(jìn)入高峰期。Caspase8的表達(dá)水平在各時(shí)間組之間均有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)并隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而逐漸增高,在21d組時(shí)達(dá)到高峰值。Caspase3的表達(dá)水平在第7d時(shí)達(dá)到高峰值且明顯高于14d組(P0.05)。檢測細(xì)胞存活狀態(tài)的流式細(xì)胞術(shù)的結(jié)果顯示,細(xì)胞存活率在誘導(dǎo)反應(yīng)的整個(gè)過程中是隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長而趨于下降,細(xì)胞的早期凋亡率和晚期凋亡以誘導(dǎo)時(shí)間的變化而趨于升高,細(xì)胞壞死率在各組之間無明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。MTT的結(jié)果顯示,細(xì)胞的存活數(shù)量以誘導(dǎo)時(shí)間的變化而趨于下降。結(jié)論死亡受體信號傳導(dǎo)途徑是ADSC誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過程中介導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要通路,特別是TNFR1/TNFα途徑。雖然Fas/FasL和DR5/TRAIL信號傳導(dǎo)通路在7d以前同樣是引發(fā)細(xì)胞凋亡的重要信號傳導(dǎo)通路,到14d時(shí)其作用明顯減弱。DR5/TRAIL途徑在7d時(shí)立即就明顯減弱,沒有出現(xiàn)明顯高峰平臺期。
【關(guān)鍵詞】：脂肪基質(zhì)細(xì)胞 體外誘導(dǎo)分化反應(yīng) 星形膠質(zhì)細(xì)胞 Fas/fasL TNFR-1/TNFα DR5/TRAIL
【學(xué)位授予單位】：華北理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R741
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 引言11-13
• 第1章 實(shí)驗(yàn)研究13-40
• 1.1 材料與方法13-24
• 1.1.1 材料13-18
• 1.1.2 實(shí)驗(yàn)方法18-24
• 1.2 結(jié)果24-34
• 1.2.1 未誘導(dǎo)的脂肪基質(zhì)細(xì)胞、傳代以及星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞形態(tài)學(xué)特征24
• 1.2.2 免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測ADSC誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過程中各個(gè)因子的表達(dá)結(jié)果24-28
• 1.2.3 用Western blotting定量檢測誘導(dǎo)反應(yīng)中各個(gè)因子的表達(dá)水平28-32
• 1.2.4 用流氏細(xì)胞術(shù)檢測誘導(dǎo)反應(yīng)中細(xì)胞的凋亡率情況32-33
• 1.2.5 用MTT法檢測脂肪基質(zhì)細(xì)胞細(xì)胞誘導(dǎo)分化為星形膠質(zhì)細(xì)胞過程中生長狀態(tài)的結(jié)果33-34
• 1.3 討論34-36
• 參考文獻(xiàn)36-40
• 第2章 綜述 死亡受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡研究進(jìn)展簡述題40-47
• 2.1 死亡受體與細(xì)胞凋亡關(guān)系的簡介40-41
• 2.2 死亡受體的基本結(jié)構(gòu)特征41
• 2.3 TNFR信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑41-42
• 2.4 Fas介導(dǎo)的凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制42-43
• 2.5 TRAILR/TRAIL信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制43-44
• 2.6 結(jié)語44
• 參考文獻(xiàn)44-47
• 結(jié)論47-48
• 致謝48-49
• 導(dǎo)師簡介49-50
• 作者簡介50-51
• 學(xué)位論文數(shù)據(jù)集51

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本文編號：1128052