本文關(guān)鍵詞：ATP13A2參與突觸核蛋白synuclein病理學(xué)作用機(jī)理研究

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【摘要】：Parkinson's Disease(PD)是一種多系統(tǒng)功能障礙為主要表現(xiàn)的神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病,病理學(xué)特征是黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元損失和路易體(Lewy body)形成。氧化應(yīng)激、蛋白質(zhì)誤折疊和聚集的增多都涉及在PD的病理學(xué)變化中,而多巴胺能神經(jīng)元退化的精確描述仍存在空缺。越來越多的遺傳和生化研究揭示自噬溶酶體途徑的功能障礙在帕金森病(PD)發(fā)病機(jī)制中有重要作用。目前,大多數(shù)研究集中在突觸核蛋白次級(jí)聚集引起的神經(jīng)毒性累積。在依賴于年齡的PD病人中,出現(xiàn)了溶酶體功能的損傷。這表明自噬溶酶體系統(tǒng)的缺陷似乎也可通過多種機(jī)制引起自噬神經(jīng)毒性。ATP13A2在哺乳動(dòng)物中腦有很高的表達(dá)量,其突變可導(dǎo)致被稱作Kufor-Rakeb syndrome(KRS)的神經(jīng)退行性疾病。ATP13A2部分定位于溶酶體膜,推測(cè)其功能為陽(yáng)離子轉(zhuǎn)運(yùn)體。ATP13A2突變后對(duì)自噬溶酶體途徑是否有影響,突變的ATP13A2是否參與突觸核蛋白病理學(xué),促進(jìn)神經(jīng)元的退化還尚未可知。為了探究這些問題,我們構(gòu)建了 ATP13A2野生及突變的穩(wěn)轉(zhuǎn)B103神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞株,研究ATP13A2突變基因?qū)ι窠?jīng)元的損傷作用,以及對(duì)自噬溶酶體途徑的影響。同時(shí)在β-syn穩(wěn)轉(zhuǎn)B103細(xì)胞株中,過表達(dá)ATP13A2野生及突變質(zhì)粒,研究在ATP13A2作用下,突觸核蛋白病理學(xué)的變化。通過免疫熒光及免疫印跡技術(shù),我們?cè)贏TP13A2穩(wěn)轉(zhuǎn)B103細(xì)胞株中發(fā)現(xiàn):野生型ATP13A2呈聚集狀態(tài)并主要定位于溶酶體,過表達(dá)ATP13A2野生型蛋白后,輕微的降低溶酶體的活性。而突變型ATP13A2蛋白在B103細(xì)胞中出現(xiàn)部分彌散的現(xiàn)象,在溶酶體的定位程度增高,顯著降低了溶酶體活力。而突變型ATP13A2蛋白在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)積留,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,并引起線粒體連續(xù)性降低,減弱了線粒體融合能力。ATP13A2突變蛋白引起自噬,主要通過自噬溶酶體系統(tǒng)降解。在β-syn穩(wěn)轉(zhuǎn)B103細(xì)胞株中,過表達(dá)突變型ATP13A2蛋白后,抑制了突觸核蛋白降解,促進(jìn)突觸核蛋白聚集。LDH和WST-1顯示,ATP13A2突變蛋白有明顯的神經(jīng)毒性作用�？偟膩碚f,ATP13A2在維持細(xì)胞內(nèi)溶酶體活性方面有著重要作用,突變型ATP13A2引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,線粒體連續(xù)性降低,增加了神經(jīng)毒性。同時(shí)突變ATP13A2降低突觸核蛋白降解,促進(jìn)突觸核蛋白聚集形成包涵體,加劇了突觸核蛋白引起的神經(jīng)退化。
【關(guān)鍵詞】：ATP13A2 溶酶體 自噬 突觸核蛋白
【學(xué)位授予單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-10
• 1. 引言10-14
• 1.1 帕金森病10
• 1.2 ATP13A2(PARK9)10-11
• 1.2.1 ATP13A2的功能與分布10-11
• 1.2.2 ATP13A2突變與帕金森癥11
• 1.3 突觸核蛋白病理學(xué)11-12
• 1.3.1 β-synuclein與α-synclein12
• 1.3.2 β-syn與PD12
• 1.4 自噬12-14
• 1.4.1 自噬與自噬信號(hào)通路12-13
• 1.4.2 帕金森病與自噬13
• 1.4.3 ATP13A2與自噬13-14
• 2. 材料和方法14-25
• 2.1 ATP13A2野生及穩(wěn)轉(zhuǎn)質(zhì)粒的提取及鑒定14-17
• 2.1.1 主要儀器與設(shè)備14
• 2.1.2 試劑及配制方法14-15
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)步驟15-17
• 2.2 ATP13A2及β-syn質(zhì)粒的表達(dá)與穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞系的建立17-21
• 2.2.1 主要儀器與設(shè)備17
• 2.2.2 常用試劑及配制17-19
• 2.2.3 B103細(xì)胞抗藥性能力評(píng)估:19
• 2.2.4 轉(zhuǎn)染、藥殺19-20
• 2.2.5 單克隆挑取20
• 2.2.6 免疫印跡樣品蛋白裂解20
• 2.2.7 免疫印跡20-21
• 2.3 免疫熒光雙標(biāo)及細(xì)胞增殖、凋亡檢測(cè)、酶活力檢測(cè)、線粒體提取21-25
• 2.3.1 主要儀器與設(shè)備21-22
• 2.3.2 主要試劑及配制方法22
• 2.3.3 LDH細(xì)胞毒性檢測(cè)22-23
• 2.3.4 WST-1細(xì)胞存活率檢測(cè)23
• 2.3.5 免疫細(xì)胞化學(xué)23-24
• 2.3.6 組織蛋白酶D及26-S蛋白酶體活性測(cè)定24
• 2.3.7 線粒體提取24
• 2.3.8 數(shù)據(jù)分析統(tǒng)計(jì)軟件及方法24-25
• 3. 結(jié)果與討論25-46
• 3.1 ATP13A2真核表達(dá)質(zhì)粒的提取鑒定25-28
• 3.2 ATP13A2在B103細(xì)胞中的分布28-29
• 3.3 ATP13A2在各細(xì)胞器中的分布以及對(duì)各細(xì)胞器的影響29-40
• 3.4 ATP13A2與突觸核蛋白病理學(xué)40-46
• 4. 結(jié)論與展望46-51
• 參考文獻(xiàn)51-61
• 致謝61-62
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄62

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