本文關(guān)鍵詞：CRMP2對大鼠缺血再灌注腦損傷后細胞凋亡及神經(jīng)再生的影響研究

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【摘要】：背景及目的急性缺血性腦卒中患者超早期靜脈溶栓或動脈血管機械開通術(shù)可以恢復(fù)腦血流,避免腦梗死形成,保留神經(jīng)功能。但早期腦缺血再灌注后將引起一系列級聯(lián)反應(yīng)損傷腦細胞,其機制涉及腦組織能量代謝紊亂、興奮性氨基酸毒性、細胞內(nèi)鈣超載、氧化應(yīng)激損傷、炎癥反應(yīng)等諸多環(huán)節(jié)。最后,由于激活細胞凋亡基因?qū)е录毎绦蛐运劳?使缺血半暗帶區(qū)與梗死區(qū)融合。因此,血管再通也會造成神經(jīng)細胞的損傷,腦梗死的治療仍然需要神經(jīng)保護劑的參與。神經(jīng)保護指在急性缺血性腦卒中的治療中,阻止缺血引起的腦組織一系列的病理生理反應(yīng),干擾缺血瀑布反應(yīng)的各個環(huán)節(jié),延長神經(jīng)元存活的藥物或措施。腦衰反應(yīng)調(diào)節(jié)蛋白2(Collapsin response mediator protein 2,CRMP2)是胞質(zhì)磷酸化蛋白CRMP1-5家族的成員之一,該家族參與了神經(jīng)元分化及軸突導(dǎo)向,并在發(fā)育期腦組織中豐富表達。CRMP2已被證實在諸多神經(jīng)系統(tǒng)疾病中具有神經(jīng)保護作用,如阿爾茲海默病、精神分裂癥以及腦血管病等。本課題組前期實驗證實,CRMP2有利于大鼠缺血再灌注后神經(jīng)軸突的修復(fù)。國內(nèi)外大量研究證實CRMP2在神經(jīng)修復(fù)、促軸突再生方面的強大作用也顯示了其良好的神經(jīng)保護潛能。然而,其在腦缺血再灌注損傷后的具體保護作用及機制尚不明確。本研究擬通過外源性上調(diào)CRMP2在腦組織中的表達,探討其對缺血再灌注后神經(jīng)細胞凋亡及神經(jīng)再生的影響及可能機制。方法第一部分1.健康成年雄性SD大鼠18只,體重250-300g,由重慶醫(yī)科大學(xué)實驗動物中心提供,隨機分為正常組(Normal),對照組(Control)即單純?nèi)毖俟嘧⒔M,側(cè)腦室加空質(zhì)粒組(LV+VP),海馬加空質(zhì)粒組(H+VP),皮質(zhì)加空質(zhì)粒組(C+VP),嗅球加空質(zhì)粒組(OB+VP),每組n=3,Western blot檢測各組CRMP2的表達。2.成年雄性SD大鼠100只,隨機分為空白質(zhì)粒組(VP)、側(cè)腦室組(LV)、海馬組(H)、皮質(zhì)組(C)及嗅球組(OB),每組n=20,24h和48h各10只(5只用于GFP檢測,5只用于Western blot及q-PCR檢測)。第二部分1.雄性SD大鼠100只,側(cè)腦室注射1天,制作MCAO/再灌注模型,隨機分為sham組,MCAO組,MCAO+GFP組,MCAO+CRMP2/GFP組。缺血再灌注48h、1w,Western blot檢測腦缺血損傷后CRMP2、AIF及NMDAR2B的表達。TUNEL法檢測腦缺血損傷后凋亡細胞。2.熒光定量PCR檢測各組腦缺血損傷后48h、1w各組大鼠缺血灶周圍腦組織CRMP2、Bcl2、Caspase3、Caspase8及P53的表達。3.腦缺血再灌注損傷后48h,TTC檢測各組大鼠腦梗死體積;48h、1w,對各組大鼠進行神經(jīng)功能缺損評分,比較過表達CRMP2干預(yù)對腦缺血損傷后大鼠神經(jīng)功能恢復(fù)的影響。第三部分1.雄性SD大鼠120只,側(cè)腦室注射質(zhì)粒1天后,制作MCAO/再灌注模型,隨機分為sham組,MCAO組,MCAO+GFP組,MCAO+CRMP2/GFP組。缺血再灌注7天免疫熒光檢測缺血側(cè)皮質(zhì)GFAP及MAP2的表達。再灌注后5-7天腹腔注射Edu,熒光檢測SVZ區(qū)及皮質(zhì)Edu標(biāo)記的陽性細胞數(shù);免疫熒光檢測Nestin/Edu及DCX/Edu標(biāo)記陽性細胞數(shù)。再灌注后14天免疫熒光檢測GFAP/Edu及MAP2/Edu標(biāo)記的陽性表達量。2.Western blot檢測7天、14天BDNF的表達;免疫組化檢測7天、14天缺血側(cè)BDNF及NGF的表達。大鼠灌注取腦前進行神經(jīng)功能評分。結(jié)果第一部分海馬和側(cè)腦室注射CRMP2真核表達質(zhì)粒后24h及48h激光共聚焦結(jié)果顯示:24h側(cè)腦室和海馬的GFP的表達量均較48h多;不同部位注射CRMP2真核表達質(zhì)粒后,皮質(zhì)CRMP2的表達均有增高,其中側(cè)腦室組及海馬組的轉(zhuǎn)染效率明顯高于皮質(zhì)組及嗅球組(p0.01),而側(cè)腦室組比海馬組稍高,但統(tǒng)計學(xué)差異不明顯(p0.05)第二部分1.腦缺血損傷后48 h及1 w CRMP2蛋白表達降低,CRMP2真核質(zhì)粒干預(yù)后,CRMP2的蛋白表達明顯升高(p0.01)。腦缺血再灌注損傷后,缺血灶周圍腦組織TUNEL陽性細胞表達量增多,CRMP2真核表達質(zhì)粒干預(yù)使TUNEL陽性細胞減少(p0.01)。2.腦缺血再灌注48 h及1 w,與sham組比較,缺血再灌注后BCL2的m RNA的表達水平明顯降低(p0.01),而同時Caspase-3、Caspase-8以及P53的m RNA表達升高(p0.01);與MCAO及MCAO+GFP組比,真核質(zhì)粒干預(yù)腦缺血組織后升高了BCL2的m RNA水平(p0.01),同時明顯降低了P53、Caspase-3、Caspase-8的m RNA水平(p0.01)。與假手術(shù)相比,腦缺血再灌注損傷還使細胞核AIF蛋白表達量增加,而過表達CRMP2使細胞核AIF表達量降低(p0.01)。3.與sham組相比,48h及1w腦缺血再灌注損傷使NMDAR2B表達量升高,而過表達CRMP2降低了其表達(p0.01)。4.再灌注后48 h,MCAO組及MCAO+GFP組大鼠缺血側(cè)可見明顯的梗死灶,并伴有嚴(yán)重的神經(jīng)功能缺損(p0.01);真核質(zhì)粒干預(yù)后梗死灶明顯縮小(p0.01),神經(jīng)功能缺損明顯減輕(p0.01)。1 w后,缺血各組大鼠的神經(jīng)功能均有所恢復(fù),但MCAO+CRMP2/GFP組的神經(jīng)功能評分明顯高于其他兩組(p0.01)。第三部分1.與sham組相比,再灌注后7天,MCAO組大鼠可見明顯的神經(jīng)元的丟失及大量膠質(zhì)細胞的激活。MCAO+GFP組大鼠皮質(zhì)MAP2及GFAP的表達與MCAO組無明顯差異(p0.05)。而CRMP2真核質(zhì)粒干預(yù)后,MAP2表達增多(p0.01),GFAP的表達明顯減少(p0.01)。2.與假手術(shù)比,腦缺血再灌注損傷,促進了SVZ區(qū)及缺血皮質(zhì)區(qū)Edu標(biāo)記陽性細胞的表達(p0.05);而CRMP2真核質(zhì)粒干預(yù)之后Edu在兩個部位的表達量較其余三組均增多(p0.05),提示過表達的CRMP2可促進神經(jīng)細胞增殖。免疫熒光雙標(biāo)顯示,缺血再灌注后7d,MCAO組及MCAO+GFP組Nestin與Edu及DCX/Edu的雙標(biāo)陽性細胞數(shù)量較假手術(shù)組明顯增多(p0.05),而兩組之間無明顯差異(p0.05)。過表達CRMP2之后Nestin與Edu及DCX/Edu的雙標(biāo)數(shù)量較其余三個組明顯增多(p0.05),提示CRMP2促進了內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖。3.缺血再灌注后14d,MCAO組及MCAO+GFP組可見明顯的MAP2與Edu雙標(biāo)表達,CRMP2真核表達質(zhì)粒干預(yù)組MAP2與Edu雙標(biāo)的表達量較MCAO組及MCAO+GFP組明顯增多(p0.05);缺血再灌注后14d,CRMP2真核表達質(zhì)粒干預(yù)組GFAP與Edu雙標(biāo)的表達量較MCAO組及MCAO+GFP組無明顯差異(p0.05)。4.缺血再灌注后7d與14d可見BDNF及NGF的表達量明顯增多,而過表達CRMP2使BDNF及NGF的表達量均進一步升高(p0.05)。同時,與MCAO組及MCAO+GFP組相比,過表CRMP2使大鼠神經(jīng)功能缺損明顯減輕(p0.05)。結(jié)論1.CRMP2真核表達質(zhì)粒能夠成功轉(zhuǎn)染大鼠腦組織,使缺血區(qū)皮質(zhì)CRMP2蛋白及m RNA的表達明顯增高。側(cè)腦室的轉(zhuǎn)染效率較其他三個部位更高。2.CRMP2對Caspase依賴的線粒體凋亡通路以及AIF異位均有調(diào)控作用,從而減少了腦缺血再灌注損傷后的神經(jīng)細胞凋亡及腦梗死體積,起到了神經(jīng)保護作用。而其對凋亡通路的調(diào)控,可能是通過影響NMDAR2B受體實現(xiàn)的。3.CRMP2減少了大鼠腦缺血再灌注損傷后神經(jīng)元的丟失;通過影響B(tài)DNF及NGF的表達,促進了大鼠腦缺血再灌注損傷后內(nèi)源性神經(jīng)干細胞的增殖、分化為成熟的神經(jīng)元。
【關(guān)鍵詞】：CRMP2 腦缺血/再灌注 凋亡 神經(jīng)再生
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-5
• 中文摘要5-11
• 英文摘要11-17
• 前言17-20
• 第一部分 CRMP2真核表達質(zhì)粒在缺血/再灌注大鼠腦皮質(zhì)轉(zhuǎn)染效率的對比研究20-37
• 前言20
• 1 材料與方法20-29
• 2 結(jié)果29-31
• 3 討論31-33
• 參考文獻33-37
• 第二部分 CRMP2對缺血再灌注腦損傷后神經(jīng)細胞凋亡的影響及可能機制研究37-54
• 前言37
• 1 材料與方法37-41
• 2 結(jié)果41-48
• 3 討論48-51
• 參考文獻51-54
• 第三部分 CRMP2對缺血再灌注腦損傷后神經(jīng)再生影響及機制54-70
• 前言54
• 1 材料與方法54-59
• 2 結(jié)果59-65
• 3 討論65-67
• 參考文獻67-70
• 附圖70-78
• 文獻綜述：CRMP2與腦卒中后的神經(jīng)保護78-87
• 參考文獻83-87
• 致謝87-88
• 攻讀碩士期間發(fā)表文章88

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