本文關(guān)鍵詞：GM1聯(lián)合生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞的研究

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【摘要】：目的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(BMSCs)是一群能不斷自我更新、分裂增殖,且具多譜系分化潛能的多能干細(xì)胞。堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(b FGF)和表皮生長(zhǎng)因子(EGF)能有效促進(jìn)BMSCs向神經(jīng)元樣細(xì)胞分化,且對(duì)細(xì)胞幾乎無(wú)毒副作用。單唾液酸四己糖神經(jīng)節(jié)苷脂(GM1)是神經(jīng)細(xì)胞質(zhì)膜的重要組成成分,對(duì)神經(jīng)細(xì)胞分化和成熟過(guò)程必不可少,并可保護(hù)和修復(fù)受損神經(jīng)細(xì)胞。本研究旨在探討GM1聯(lián)合生長(zhǎng)因子(b FGF+EGF)能否更為高效地促進(jìn)BMSCs分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞,從而為細(xì)胞替代治療神經(jīng)系統(tǒng)變性疾病提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法采用密度梯度離心法獲取骨髓單個(gè)核細(xì)胞,行原代、傳代培養(yǎng),觀察細(xì)胞形態(tài)變化和生長(zhǎng)情況;取第3代BMSCs,用流式細(xì)胞術(shù)鑒定其表面標(biāo)志物(CD29、CD105、CD34、CD45);同時(shí)鑒定其多分化潛能。將第3代BMSCs分四組向神經(jīng)元樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化,A組:單用生長(zhǎng)因子(b FGF+EGF);B組:單用GM1;C組:GM1聯(lián)合生長(zhǎng)因子(b FGF+EGF);D組:對(duì)照組。分別在正式誘導(dǎo)前、后行免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測(cè)各組細(xì)胞Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP的陽(yáng)性表達(dá)率并用SPSS18.0進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析。結(jié)果骨髓單個(gè)核細(xì)胞接種于培養(yǎng)瓶24h后可見(jiàn)多數(shù)細(xì)胞已貼壁,48h首次全量換液,可見(jiàn)較多骨髓單個(gè)核細(xì)胞散在分布。原代培養(yǎng)5-6天可見(jiàn)散在分布的短梭形、多角形或?qū)挻蟊馄叫渭?xì)胞而形成的集落;8-11天,細(xì)胞生長(zhǎng)速度明顯加快,形態(tài)逐漸變成梭形;14-16天,細(xì)胞逐漸鋪滿培養(yǎng)瓶底,可達(dá)80%-90%融合,呈漩渦狀分布;傳代后的細(xì)胞,形態(tài)與原代相似,但其生長(zhǎng)潛伏期明顯縮短。流式細(xì)胞術(shù)鑒定第3代BMSCs表面標(biāo)志物呈CD29(+)、CD105(+)、CD34(-)、CD45(-);同時(shí)其具分化為成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞潛能。BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞之前,四組細(xì)胞Nestin、β-Tubulin、GFAP表達(dá)均呈陰性;正式誘導(dǎo)2-4天,A、B、C三組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均呈上升趨勢(shì),且C組高于A、B、D組;正式誘導(dǎo)6-8天,A、B、C三組Nestin陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均有所降低,而β-TubulinⅢ、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率則呈較明顯上升趨勢(shì),且C組較A、B組升高明顯。綜合實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù),C組的Nestin、β-TubulinⅢ、GFAP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)率均高于A、B、D組。結(jié)論1.采用密度梯度離心法結(jié)合細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法來(lái)分離、培養(yǎng)BMSCs,可獲得較高純度的BMSCs,且細(xì)胞活性較高,適用于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)研究。2.GM1聯(lián)合生長(zhǎng)因子(b FGF+EGF)相比單獨(dú)的生長(zhǎng)因子(b FGF+EGF)或GM1,可更為高效地促進(jìn)BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞。
【關(guān)鍵詞】：骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 GM1 生長(zhǎng)因子 誘導(dǎo) 神經(jīng)元樣細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：寧波大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R741
【目錄】：

• 摘要4-6
• 英文摘要6-10
• 引言10-13
• 1 BMSCs的分離、原代及傳代培養(yǎng)、凍存和鑒定13-23
• 1.1 實(shí)驗(yàn)材料13-14
• 1.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑13-14
• 1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器14
• 1.2 實(shí)驗(yàn)方法14-17
• 1.2.1 BMSCs的分離、原代及傳代培養(yǎng)14-15
• 1.2.2 細(xì)胞計(jì)數(shù)15
• 1.2.3 細(xì)胞活性檢測(cè)15
• 1.2.4 細(xì)胞凍存和復(fù)蘇15-16
• 1.2.5 流式細(xì)胞術(shù)鑒定BMSCs的純度16
• 1.2.6 BMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鑒定16-17
• 1.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果17-20
• 1.3.1 BMSCs的分離、原代及傳代培養(yǎng)結(jié)果17-18
• 1.3.2 細(xì)胞活性檢測(cè)結(jié)果18-19
• 1.3.3 BMSCs表面標(biāo)志物鑒定結(jié)果19
• 1.3.4 BMSCs向成骨細(xì)胞和成脂細(xì)胞誘導(dǎo)分化的鑒定結(jié)果19-20
• 1.4 討論20-23
• 2 BMSCs誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞23-32
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料23-24
• 2.1.1 主要實(shí)驗(yàn)試劑23
• 2.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法24-25
• 2.2.1 玻片預(yù)處理24
• 2.2.2 BMSCs定向誘導(dǎo)分化為神經(jīng)元樣細(xì)胞24
• 2.2.3 免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)元樣細(xì)胞24-25
• 2.2.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析25
• 2.3 結(jié)果25-29
• 2.3.1 免疫細(xì)胞化學(xué)法鑒定神經(jīng)元樣細(xì)胞結(jié)果及數(shù)據(jù)分析25-29
• 2.4 討論29-32
• 3 結(jié)論32
• 參考文獻(xiàn)32-35
• 附錄A 縮略詞表(Abbreviation)35-36
• 附錄B 文獻(xiàn)綜述36-43
• 參考文獻(xiàn)40-43
• 在學(xué)研究成果43-44
• 致謝44

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