【摘要】 在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的腫瘤，來源于神經(jīng)上皮細(xì)胞，發(fā)病率占全部原發(fā)腦腫瘤的40%以上，目前，由于對其發(fā)病機(jī)制尚不明了，依現(xiàn)有的治療手段很難以治愈，所以主要以手術(shù)切除為目前的治療手段，輔以放、化療。但由于腫瘤與正常腦組織無明顯界限，很難達(dá)到徹底根治，致使術(shù)后復(fù)發(fā)率極高，且生存期較短，由此可見，是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一，也是神經(jīng)外科高死亡率疾病之一，也是困擾臨床大夫的主要問題和尚待解決的難題。近年來的探索和研究神經(jīng)膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展中的改變，將有利于更好的理解神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病機(jī)制和發(fā)現(xiàn)腫瘤標(biāo)志物提供研究基礎(chǔ)，為開展膠質(zhì)瘤個(gè)體化治療提供理論依據(jù)。SEMA3B是近年發(fā)現(xiàn)的候選腫瘤抑制基因，位于3號染色體短臂21．3區(qū)域，屬于Semaphorins蛋白家族，均屬分泌型蛋白，Semaphorins家族蛋白具有多種生物活性，參與神經(jīng)細(xì)胞再生、腫瘤形成、心臟血管的形態(tài)形成、免疫應(yīng)答、神經(jīng)細(xì)胞凋亡、血管內(nèi)皮細(xì)胞遷移等諸多生理功能。我們通過對69例原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤腫瘤組織包埋蠟塊和10例正常腦組織包埋蠟塊進(jìn)行了免疫組織化學(xué)和相關(guān)臨床特點(diǎn)分析， VEGF、NRP1、NRP2在正常腦組織中均表達(dá)為1例弱陽性。69例原發(fā)神經(jīng)膠質(zhì)瘤中VEGF、 NRP1、 NRP2陽性表達(dá)率分別為74.00%(51/69)、77.00%(53/69)、72.00%(50/69)，明顯高于正常腦組織組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。低惡性度組(Ⅰ-Ⅱ級)和高惡性度組(Ⅲ-Ⅳ級)中VEGF、NRP1、NRP2的陽性表達(dá)率分別為：69.00%(20/29)、76.00%(22/29)、72.00%(21/29)；80.00%(32/40)、83.00%(33/40)、78.00%(31/40)；提示隨腫瘤分級增加而增強(qiáng)（與膠質(zhì)瘤惡性程度呈正相關(guān)），兩組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。通過分析43例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和3例正常腦組織的DNA甲基化，SEMA3B基因發(fā)生甲基化頻率為21/43（48.8%），而正常腦組織均未發(fā)生甲基化。SEMA3B基因參與了DNA的修復(fù)和細(xì)胞凋亡，啟動(dòng)子的部分甲基化可能導(dǎo)致了其表達(dá)的下調(diào)原因之一，為神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展提供了選擇性優(yōu)勢，可能影響腫瘤細(xì)胞的凋亡和遷移。為了明確SEMA3B基因的甲基化位點(diǎn)，選取43例神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織和3例正常腦組織進(jìn)行焦磷酸測序，與正常的腦組織相比，神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中SEMA3B基因的啟動(dòng)子區(qū)存在高密度的甲基化位點(diǎn)，SEMA3B基因啟動(dòng)子區(qū)的甲基化可能有腫瘤特異性，可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織與正常腦組織區(qū)別的重要分子標(biāo)志物。SEMA3B基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與惡性程度呈正相關(guān)。為了進(jìn)一步了解神經(jīng)膠質(zhì)瘤的特性，以體外培養(yǎng)人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251，并添加藥物布魯生（Brucine），利用qRT-PCT技術(shù)、MTT凋亡檢測方法和流式細(xì)胞儀，觀察Brucine對神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞凋亡的影響。結(jié)果顯示，Brucine下調(diào)COX-2、BCL-2mRNA的表達(dá)，上調(diào)BAX mRNA的表達(dá)；而且，Brucine抑制神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡。故此，推測SEMA3B可能與神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的凋亡相關(guān)�？梢詾樯窠�(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞研究及其臨床介入治療提供實(shí)驗(yàn)支持。綜上所述，惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段、多因素作用的產(chǎn)物，為尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤的診斷治療和預(yù)后提供理論基礎(chǔ)，SEMA3B基因可能是神經(jīng)膠質(zhì)瘤治療的一個(gè)新的靶點(diǎn)。 

第 1 章 緒 論

在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，神經(jīng)膠質(zhì)瘤是最常見的腫瘤，來源于神經(jīng)上皮細(xì)胞，發(fā)病率占全部原發(fā)腦腫瘤的 40%以上[1-4]，原發(fā)性腦腫瘤患病率呈逐年遞增趨勢，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，年增長率為1.2%，尤以中老年人群較為顯著。我國原發(fā)性神經(jīng)膠質(zhì)瘤年發(fā)病率為3-6/10萬人，每年死亡人數(shù)達(dá)到 3 萬人以上，所以是全身腫瘤中預(yù)后最差的腫瘤之一，也是神經(jīng)外科高死亡率疾病之一，也是一直困擾臨床大夫的主要問題和尚待解決的難題。目前。由于對其發(fā)病機(jī)制尚不明了，依現(xiàn)有的治療手段很難以達(dá)到治愈，所以主要以手術(shù)切除為目前的治療手段，緊隨其后化療和放療［5-6］。但最常見的原發(fā)性腦腫瘤，仍然還不能達(dá)到最佳治療標(biāo)準(zhǔn)。短期內(nèi)復(fù)發(fā)，一直都是臨床上非常厄待解決的難題。相對目前為什么會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)細(xì)胞的惡變、膠質(zhì)瘤細(xì)胞的進(jìn)展如何和短期復(fù)發(fā)的因素尚未明了，現(xiàn)在環(huán)境因素、化學(xué)因素、電離輻射和遺傳因素等可能都會(huì)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤發(fā)病。有研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)瘤的局部侵襲和轉(zhuǎn)移與細(xì)胞增殖、分化異常和細(xì)胞凋亡等多種機(jī)制有關(guān)［7-9］。尋找神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)生發(fā)展過程中，抑癌基因及其表達(dá)的改變和神經(jīng)膠質(zhì)瘤的發(fā)病關(guān)系，如 p53,RB,PTEN,p16,Mxil,CDKN2A,NF1 等都已被證實(shí)，有效的明確生物分子間和遺傳信息，不僅可以進(jìn)行對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的精確定位，還可以提供相應(yīng)的腫瘤標(biāo)志物，為疾病的臨床診斷和預(yù)后提供評估。
腫瘤的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多基因、多階段、多因素參與的過程。惡性腫瘤是一種基因組的疾病，主要特征是原癌基因（生長因子及其受體、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)因子和基因轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子等）的激活和抑癌基因的失活。失活是抑癌基因啟動(dòng)子區(qū)域的甲基化的重要分子機(jī)制［10］。如神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞過度生長，加速了腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散，從而使基因發(fā)生突變，過度表達(dá)或異常表達(dá)，引起腫瘤細(xì)胞的凋亡信號的失活，反之，誘導(dǎo)過度增生的細(xì)胞凋亡、上皮細(xì)胞的修復(fù)等，導(dǎo)致抑制腫瘤的發(fā)生。
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1.1 Semaphorins 3 家族研究進(jìn)展
Sema 3s家族被首次發(fā)現(xiàn)具有軸突導(dǎo)向分子,而在脊椎動(dòng)物是唯一分泌Semaphorin家族的成員。已知的生理和病理功能已經(jīng)擴(kuò)展到包括軸突的吸引力和排斥細(xì)胞凋亡、細(xì)胞遷移、生長錐崩潰、免疫反應(yīng)、器官形成、腫瘤抑制和促進(jìn)、脈管系統(tǒng)的發(fā)展[35-39]。我們理解這些Sema 3s的功能是對我們理解受體至關(guān)重要的。然而,我們的知識(shí)對Sema3s體系的構(gòu)成還遠(yuǎn)未完成,我們?nèi)狈υ敿?xì)、全面的審查[40]。作為Sema 3s受體,從生物、生化和體內(nèi)分析推導(dǎo),特別強(qiáng)調(diào)神經(jīng)細(xì)胞。我們希望有助于揭示最需要進(jìn)一步研究的領(lǐng)域。
1.1.1 Semaphorins(Sema3s)家族結(jié)果的一般受體
Sema 3s的受體是雜合物的二級受體,顯著不同重疊Sema 3s的整體受體[41]。兩個(gè)Nrp1和Nrp2被發(fā)現(xiàn)是Sema 3s信號轉(zhuǎn)導(dǎo)的必需品,但是Sema 3s的特異性信號不能單獨(dú)歸因于Neuropilin。事實(shí)上,即使之前發(fā)現(xiàn)Neuropilins 是Sema 3s所必需的信號,從他的結(jié)構(gòu)推斷老鼠的神經(jīng)系統(tǒng)Nrp1 表達(dá)發(fā)展中Nrp1可能是被異染的。同時(shí),從胞質(zhì)域Nrp1 發(fā)現(xiàn)Sema3s不需要信號,表明Neuropilins一致行動(dòng)與其他受體作為應(yīng)變轉(zhuǎn)換細(xì)胞外信號的細(xì)胞內(nèi)信號通路。
Plexins(PlexinAs)類是第一個(gè)確定作為Sema 3s主要的共同受體,這些初步的研究發(fā)現(xiàn),PlexinAs Neuropilins關(guān)聯(lián),這種關(guān)聯(lián)Sema 3s的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)是很重要的。進(jìn)一步的研究發(fā)現(xiàn)許多其他Sema 3s的共同受體:L1cam、Nrcam、Plxnb1、和Plxnd1。除了Sema 3E,所有需要Neuropilin受體作為Sema 3s配體結(jié)合位點(diǎn)。作為綁定Sema 3s配體的Neuropilins取決于他們N-端某序列和一個(gè)70氨基酸序列才能確定其特異性。不同數(shù)量的Sema 3s多聚體受體,與之相關(guān)聯(lián)的Plexins或細(xì)胞粘附分子提供了細(xì)胞內(nèi)信號傳導(dǎo)機(jī)制。Sema 3E不同之處在于,它能夠直接綁定Plxnd1而缺乏Neuropilin。Plexins(A類,除了Sema 3E以外的Plxnd1 )和細(xì)胞粘附分子(L1cam和Nrcam)是通過橫跨膜和細(xì)胞外域順式相互作用于Nrp1和Nrp2。
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第 2 章 實(shí)驗(yàn)研究

2.1 體內(nèi)試驗(yàn)
2.1.1 資料
2.1.1.1 研究對象
隨機(jī)抽取自2009年12月至2010年5月內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院神經(jīng)外科臨床確診手術(shù)切除的神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織蠟塊，術(shù)前均未經(jīng)任何抗腫瘤治療，術(shù)后病理診斷均為神經(jīng)膠質(zhì)瘤，其中Ⅰ級膠質(zhì)瘤4例，Ⅱ級膠質(zhì)瘤25例，Ⅲ級膠質(zhì)瘤20例，Ⅳ級膠質(zhì)瘤20例，男性36例，女性33例，男女性別之比為1.07:1，年齡17～70歲，平均48.37±12.06歲。所有切片均由專業(yè)技術(shù)人員切成5微米厚。另選取同期因急性顱腦損傷而顱內(nèi)減壓切除的正常腦組織3份作為對照組，液氮凍存?zhèn)溆谩?br /> 2.1.1.2 抗體
購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司 UltraSensitiveTMS-P 超敏試劑盒（鼠/兔）。
2.1.1.3 主要試劑盒及試劑
UltraSensitiveTM SP 超敏試劑盒，中國福州邁新生物技術(shù)公司；
DAB 顯色試劑盒，中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；
質(zhì)粒抽提試劑盒 ，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，SK8161；
蘇木素體細(xì)胞染色液，中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；
DAB 顯色試劑盒，中國福州邁新生物技術(shù)開發(fā)公司；
CpG Assay(200),Qiagen,Germany；
DNA 提取試劑盒，Qiagen,Germany；
DNA 亞硫酸氫鈉修飾，Qiagen,Germany；
NaHSO3（分析純，生工）；
PCR 產(chǎn)物純化回收試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，SK8141；
感受態(tài)細(xì)胞制備試劑盒，生工生物工程(上海)股份有限公司提供，SK9307；
TaqDNA 聚合酶 SC0010 及 dNTP，筆耕文化傳播，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
NaOH，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
氫醌，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
pUC18-T，生工生物工程(上海)股份有限公司提供；
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2.2 體外實(shí)驗(yàn)
膠質(zhì)母細(xì)胞瘤（ Glioblastoma multiforme，GBM ）已被發(fā)現(xiàn)是最普遍和最重要的原發(fā)性惡性腦腫瘤，每年影響約 25,000 例病人的生存[172-173]。目前，治療這種疾病包括手術(shù)切除和術(shù)后藥物協(xié)作的放射治療（ Radiotherapy，RT）。然而，患者的生存期仍然很短，據(jù)報(bào)道總生存期和術(shù)后 2 年生存率分別是 14.6 個(gè)月 26.5％[174]。微血管增生和彌漫性浸潤是膠質(zhì)瘤細(xì)胞的兩大生物學(xué)特性，也是導(dǎo)致此病難以治愈的原因[175]。此外，因?yàn)槟[瘤細(xì)胞浸潤正常腦組織，因此，通過手術(shù)切除腫瘤細(xì)胞具有一定的挑戰(zhàn)性[176]。目前，對于致命性的腫瘤細(xì)胞的具體治療方案已經(jīng)很多[177-179]。而且，對于不能進(jìn)行手術(shù)或承受術(shù)后復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移的患者，可以考慮采用藥物治療在一定程度控制腫瘤生長。因此，有必要開發(fā)一種具有特異性針對靶細(xì)胞（癌細(xì)胞）、毒性低、安全以及較強(qiáng)的抗腫瘤效果的新藥物，可進(jìn)行 GBM 的治療和預(yù)防復(fù)發(fā)以及轉(zhuǎn)移。
布魯生（Brucine）是一種無臭味的白色晶體。研究有發(fā)現(xiàn)，布魯生具有抗肝癌腫瘤的作用[180]，而且，布魯生抑肝癌細(xì)胞遷移和轉(zhuǎn)移[181]。據(jù)報(bào)道，布魯生抑制人肝癌細(xì)胞的生長[182-183]。因此，在本研究中，對含有不同濃度 Brucine 的培養(yǎng)體系中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 U251 的生存狀態(tài)進(jìn)行了解，這可為臨床治療以及實(shí)驗(yàn)理論提供基礎(chǔ)。
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第3章 結(jié)果 ..............................56-78 
3.1 體內(nèi)結(jié)果................................. 56-72 
3.1.1 VEGF 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)................... 56-57 
3.1.2 VEGF 在各級膠質(zhì)瘤中的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析............................ 57-58 
3.1.3 VEGF 表達(dá)與膠質(zhì)瘤相關(guān)性分析.......................... 58-59 
3.1.4 NRP-1 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) .............59-62 
3.1.5 NRP-2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá) ...........................62-65 
3.1.6 VEGF 和 NRP1/2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中表達(dá)的相關(guān)性 ................65-66 
3.1.7 神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者信息及 IOD 值 ..........................66-68 
3.1.8 SEMA 3B 基因啟動(dòng)子在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中存在甲基化 ...................68-71 
3.1.9 SEMA3B 的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤臨床病理特征和甲基化分類統(tǒng)計(jì)............................ 71-72 
3.2 體外實(shí)驗(yàn)...................................... 72-78 
3.2.1 電泳檢測人膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251 的總 RNA......................... 72-73 
3.2.2 體外培養(yǎng)過程中人膠質(zhì)瘤細(xì)胞U251 SEMA 3B、BCL-2、BAX mRNA的表達(dá)情況 .......................................73-76 
3.2.3 不同濃度 Brucine 對人腦膠質(zhì)瘤細(xì)胞 U251 細(xì)胞存活的影響............................... 76 
3.2.4 不同濃度 Brucine 對 U251 細(xì)胞凋亡的影響........................... 76-78 

第4章 討論

新血管的生成是判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤惡性程度、侵襲和預(yù)后的前提條件，腫瘤的生長需要靠新生血管來供應(yīng)營養(yǎng)物質(zhì)，那么新生血管就為腫瘤的發(fā)生發(fā)展提供了有用的營養(yǎng)物質(zhì)。國外研究表明，惡性腫瘤血管形成中VEGF起著非常重要的作用，Struger等[11]對22例腦轉(zhuǎn)移瘤組織進(jìn)行免疫組化研究，結(jié)果21例VEGF染色陽性，膠質(zhì)瘤細(xì)胞中檢測出了VEGFmRNA及VEGF蛋白，二者的表達(dá)與膠質(zhì)瘤的MVD均正相關(guān)（p<0.01）,而且隨著膠質(zhì)瘤的惡性程度增加，其水平越高，患者的預(yù)后越差。在腦膠質(zhì)瘤中腫瘤分泌VEGF遠(yuǎn)遠(yuǎn)大于正常腦組織以及其他正常器官，甚至正常的腦組織中則無表達(dá)[12]。曾冉等[13]研究表明膠質(zhì)瘤的VEGF表達(dá)水平與腫瘤的惡性度密切相關(guān)，即腫瘤的病理級別越高，腫瘤表達(dá)的VEGF水平越高。朱正權(quán)等[14]通過對94例膠質(zhì)瘤組織石蠟標(biāo)本進(jìn)行VEGF的免疫組化分析，新疆地區(qū)漢族膠質(zhì)瘤患者腫瘤的VEGF陽性率81．97％，并且與VEGF表達(dá)水平與腫瘤病理級別之間的呈顯著正相關(guān)。蘇君等[15]采用免疫組化SP二步法對24對初發(fā)低級別及復(fù)發(fā)、惡變后高級別膠質(zhì)瘤標(biāo)本分別進(jìn)行VEGF的表達(dá)檢測，表明VEGF、EGFR在低級別膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)、惡變中起到非常重要的作用。即提示VEGF在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)越高，血管生長越旺盛，為腫瘤的侵襲生長提供了有利的條件，通過增加了血管的通透性，因而加速了腫瘤細(xì)胞的生長，促進(jìn)了腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移，提示造成了腫瘤惡性程度的增高。VEGF能夠依靠特異性生長因子在調(diào)節(jié)血管發(fā)生中起到重要作用，無論腫瘤內(nèi)外都可以自分泌大量的VEGF，在腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中，可以調(diào)節(jié)腫瘤的增值遷移、分化和凋亡等，還可以通過旁分泌影響腫瘤血管的生成。由于神經(jīng)膠質(zhì)瘤生長迅速，常常會(huì)導(dǎo)致營養(yǎng)障礙，使腫瘤本身缺血、缺氧、囊性變和壞死，缺氧又會(huì)刺激腫瘤本身VEGF的分泌增多。缺氧誘導(dǎo)因子1α（hypoxia-inducible factor-1α，HIF-1α），可以上調(diào)VEGF在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)，增加了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的增殖遷移能力，隨著神經(jīng)膠質(zhì)瘤分級的增加，HIF-1α和VEGF的表達(dá)也在增強(qiáng)[111、112]。這也與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性相關(guān)，符合臨床屬性，即惡性程度高的神經(jīng)膠質(zhì)瘤，在生長過程中侵潤明顯，對患者來說易復(fù)發(fā)和預(yù)后差。VEGF在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的高表達(dá)，說明了參與了神經(jīng)膠質(zhì)瘤的生長和侵襲過程，與新生血管生成有關(guān)，表明VEGF可以作為判斷神經(jīng)膠質(zhì)瘤生物學(xué)活性的重要指標(biāo)。
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結(jié)論

1. VEGF 和 NRP1/2 在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的病理分級中的表達(dá)與神經(jīng)膠質(zhì)瘤的惡性程度成正相關(guān)，對神經(jīng)膠質(zhì)瘤的的發(fā)生發(fā)展及判斷預(yù)后可能有相關(guān)性。
2. SEMA 3B 基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤的甲基化隨著其病理級別的增加而增高，說明 SEMA3B 基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤中的表達(dá)水平與惡性程度呈正相關(guān)，其表達(dá)缺失越顯著對神經(jīng)膠質(zhì)瘤患者預(yù)后影響較大。
3. LOH 可能是 SEMA 3B 基因在神經(jīng)膠質(zhì)瘤組織中表達(dá)的缺失或下調(diào)的重要分子機(jī)制之一。
4. Brucine 在濃度 0.6mol/ml 時(shí)，在體外能誘導(dǎo)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞 U251 凋亡和抑制其遷移。
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本文編號：10948