本文關鍵詞：TREM2調(diào)控小膠質(zhì)細胞功能活化狀態(tài)參與腦保護作用機制的研究

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【摘要】：心腦血管疾病一直是危害人類健康的“頭號殺手”,而中國作為人口老齡化大國,缺血性腦中風的發(fā)病率居高不下,嚴重影響國民健康。自1994年,缺血性腦中風已成為中國大城市中第一位致死性疾病,每10萬人口中約有429~620人患此病,每年每10萬人口中約有116~142例死亡。腦對缺血缺氧等刺激非常敏感且耐受能力最差,是最容易發(fā)生缺血再灌注損傷的器官之一,其功能障礙對人的精神、情感、行為、意識以及幾乎所有的臟器功能均會產(chǎn)生不同程度的影響。腦缺血損傷后的神經(jīng)炎癥往往貫穿缺血再灌注損傷病理發(fā)展的全過程,強烈的神經(jīng)炎癥反應造成的腦繼發(fā)性損傷是目前臨床上非常棘手的問題,因而抑制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥將會為腦中風患者的治療和預后帶來曙光。小膠質(zhì)細胞作為腦內(nèi)免疫細胞的代表,其在神經(jīng)炎癥中的功能變化受到人們的廣泛關注。在缺血再灌注損傷的不同時期,小膠質(zhì)細胞的功能持續(xù)發(fā)生變化。經(jīng)典激活狀態(tài)(M1 phenotype)的小膠質(zhì)細胞在炎癥早期釋放大量炎癥因子及氧自由基等有害物質(zhì),破壞神經(jīng)元結構的完整性和功能的穩(wěn)定性;而選擇性激活狀態(tài)(M2 phenotype)的小膠質(zhì)細胞則在炎癥晚期分泌一些神經(jīng)營養(yǎng)物質(zhì),清除壞死或凋亡的神經(jīng)元碎片,促進組織膠質(zhì)瘢痕的形成以及營養(yǎng)神經(jīng)元。因而調(diào)控小膠質(zhì)細胞的功能活化狀態(tài)使其趨利避害,減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥,控制疾病的發(fā)生發(fā)展,將是防治缺血后神經(jīng)損傷的新目標。II型髓樣細胞激發(fā)受體(TREM2)是高表達于小膠質(zhì)細胞上的一種免疫球蛋白樣受體,它在自身免疫及炎癥過程中發(fā)揮“負性調(diào)節(jié)”的有益作用。那么TREM2是不是調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)轉變的關鍵靶點?調(diào)控TREM2的表達能否改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能?針對這些科學問題,我們通過體內(nèi)、體外實驗證實了上調(diào)TREM2的表達可促使小膠質(zhì)細胞由M1型向M2型轉變減輕神經(jīng)炎癥,改善缺血后神經(jīng)功能,初步闡明TREM2是調(diào)控小膠質(zhì)細胞活化狀態(tài)的重要信號分子,有助于缺血性腦中風新型治療手段和藥物的研發(fā)。實驗一:不同功能活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞中TREM2的表達【目的】觀察TREM2在M1和M2兩種不同功能活化狀態(tài)小膠質(zhì)細胞中的表達,初步明確其與M1和M2活化狀態(tài)的關系�！痉椒ā坎捎肔PS/IFN-γ定向誘導原代小膠質(zhì)細胞向M1型轉化,L-4/IL-13定向誘導原代小膠質(zhì)細胞向M2型轉化,應用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測細胞內(nèi)M1標記物i NOS、M2標記物Arg-1以及TREM2的表達�！窘Y果】LPS/IFN-γ組i NOS表達較control組多(P0.05),而IL-4/IL-13組Arg-1表達較control組多(P0.05),初步將小膠質(zhì)細胞按功能狀態(tài)區(qū)分開來,進而發(fā)現(xiàn)TREM2在IL-4/IL-13組表達升高,且與control組相比有統(tǒng)計學意義(P0.05)。免疫熒光雙標染色結果與Western Blot近乎一致�！窘Y論】TREM2在M2型小膠質(zhì)細胞上表達升高,而在M1型小膠質(zhì)細胞上表達降低。實驗二:腦缺血損傷后小膠質(zhì)細胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2的表達【目的】觀察腦缺血后再灌注不同時間點小膠質(zhì)細胞M1型和M2型標記物的變化及TREM2的表達情況�！痉椒ā繉�27只SPF級雄性C57BL/6小鼠分為Sham組和MCAO組,其中MCAO組小鼠再次隨機分為4組,即構建MCAO動物模型后,于再灌注后的6h,24h,3d和7d分別取缺血半暗帶腦組織(n=6),應用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測并觀察梗死同側區(qū)半暗帶腦組織中i NOS、IL-6、Arg-1、BDNF及TREM2的表達�！窘Y果】再灌注后6h,i NOS的表達最高(P0.01),同樣在6h這一時間點也觀察到IL-6的表達增加(P0.001),M1型標記物i NOS、IL-6在6h、24h均較對照組升高,M2型小標記物Arg-1和BDNF于再灌注后7d表達最高(P0.001)。TREM2的表達隨缺血再灌注時間的延長而逐漸增高,在3d表達最高(P0.001)�！窘Y論】腦缺血損傷后早期以M1型小膠質(zhì)細胞為主,腦缺血損傷后晚期以M2型小膠質(zhì)細胞為主,TREM2在缺血再灌注后3d即M1/M2過渡期表達最高。實驗三:下調(diào)TREM2的表達對腦缺血損傷的影響【目的】探討下調(diào)TREM2的表達后對腦梗死容積、神經(jīng)行為學評分、神經(jīng)元凋亡的影響�！痉椒ā啃坌訡57BL/6小鼠24只分為以下3組:MCAO組、si RNA組、scr RNA組,其中MCAO組處理方法同前;si RNA組、scr RNA組:側腦室注射TREM2-si RNA、control si RNA,72 h后構建MCAO模型,大腦中動脈缺血1 h后再灌注。缺血再灌注后3d取腦組織,通過TTC染色、神經(jīng)行為學評分(Longa評分)、TUNEL染色的方法對腦功能進行評估�！窘Y果】TUNEL染色結果顯示TREM2-si RNA組與MCAO組相比,神經(jīng)元凋亡數(shù)目明顯增多(P0.05),但TREM2-si RNA組的小鼠腦梗死容積和神經(jīng)行為學評分與MCAO組無統(tǒng)計學差異�！窘Y論】下調(diào)TREM2的表達后加重神經(jīng)元的凋亡。實驗四:上調(diào)TREM2的表達發(fā)揮腦保護作用【目的】探討上調(diào)TREM2的表達后對腦梗死容積、神經(jīng)行為學評分、神經(jīng)元凋亡的影響�！痉椒ā繉�32只雄性C57BL/6小鼠分為4組:MCAO組、Hsp60 2.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp60 5μg組,其中MCAO組處理方法同前;Hsp60 2.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp60 5μg組:腹腔注射Hsp60藥物1h后開始構建MCAO模型;同樣,將雄性C57BL/6小鼠24只分為Sham組、MCAO組、LV+MCAO組,其中LV+MCAO組:側腦室注射TREM2-過表達慢病毒,于10d后構建MCAO模型,大腦中動脈缺血1 h后再灌,再灌注后3d取材,通過TTC染色、神經(jīng)行為學評分(Longa評分)、TUNEL染色的方法評估腦功能�！窘Y果】Hsp60 5μg組與MCAO組相比,神經(jīng)行為學評分以及腦梗死容積減少均有統(tǒng)計學意義(P0.001),TUNEL染色表明Hsp60 3.75μg組、Hsp60 5μg組與MCAO組相比,凋亡細胞數(shù)量有所減少(P0.01)。LV+MCAO組與MCAO組相比,腦梗死容積有所減少(P0.05),M1標記物i NOS表達降低(P0.01)而M2標記物Arg-1表達升高(P0.001)�！窘Y論】Hsp60激活TREM2的表達,能夠改善缺血再灌注后神經(jīng)功能,從而發(fā)揮腦保護作用;TREM2-過表達慢病毒上調(diào)TREM2的表達,同樣發(fā)揮腦保護作用。實驗五:慢病毒調(diào)控TREM2的表達對氧糖剝奪模型后小膠質(zhì)細胞功能活化狀態(tài)的影響【目的】進一步在細胞實驗中驗證調(diào)控TREM2的表達能夠改變?nèi)毖笮∧z質(zhì)細胞功能活化狀態(tài)�！痉椒ā繉9小膠質(zhì)細胞分為以下三組,control-vector組、TREM2-vector組、TREM2-si RNA組,慢病毒轉染3d后將細胞給予氧糖剝奪模型處理4h,隨后復糖復氧24h,接著收集細胞并提取細胞蛋白用Western Blot的方法檢測i NOS、IL-6、BDNF、Arg-1的表達情況�！窘Y果】TREM2-vector組與control-vector組相比,M2標記物BDNF、Arg-1的表達均較對照組升高,且存在統(tǒng)計學差異(P0.05);TREM2-si RNA組i NOS、IL-6表達較control-vector組增加高(P0.001)�！窘Y論】上調(diào)TREM2的表達促進小膠質(zhì)細胞向M2型轉變,而下調(diào)TREM2表達促進小膠質(zhì)細胞向M1型轉變。
【關鍵詞】：TREM2 神經(jīng)炎癥 小膠質(zhì)細胞活化 腦缺血再灌注損傷
【學位授予單位】：第四軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R743.3
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-17
• 前言17-19
• 文獻回顧19-30
• 實驗一 不同功能活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細胞中TREM2 的表達30-42
• 1 材料30-33
• 2 方法33-36
• 3 結果36-40
• 4 討論40-42
• 實驗二 腦缺血損傷后小膠質(zhì)細胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2 的表達42-51
• 1 材料42-43
• 2 方法43-46
• 3 結果46-49
• 4 討論49-51
• 實驗三 下調(diào)TREM2 的表達對腦缺血損傷的影響51-57
• 1 材料51
• 2 方法51-54
• 3 結果54-56
• 4 討論56-57
• 實驗四 上調(diào)TREM2 的表達發(fā)揮腦保護作用57-62
• 1 材料57
• 2 方法57-58
• 3 結果58-61
• 4 討論61-62
• 實驗五 慢病毒調(diào)控TREM2 的表達對氧糖剝奪模型后小膠質(zhì)細胞功能活化狀態(tài)的影響62-66
• 1 材料62
• 2 方法62-63
• 3 結果63-65
• 4 討論65-66
• 小結66-67
• 參考文獻67-74
• 附錄74-76
• 個人簡歷和研究成果76-77
• 致謝77-78

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本文編號：1049690