本文關(guān)鍵詞：TREM2調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)參與腦保護(hù)作用機(jī)制的研究

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【摘要】：心腦血管疾病一直是危害人類健康的“頭號(hào)殺手”,而中國(guó)作為人口老齡化大國(guó),缺血性腦中風(fēng)的發(fā)病率居高不下,嚴(yán)重影響國(guó)民健康。自1994年,缺血性腦中風(fēng)已成為中國(guó)大城市中第一位致死性疾病,每10萬(wàn)人口中約有429~620人患此病,每年每10萬(wàn)人口中約有116~142例死亡。腦對(duì)缺血缺氧等刺激非常敏感且耐受能力最差,是最容易發(fā)生缺血再灌注損傷的器官之一,其功能障礙對(duì)人的精神、情感、行為、意識(shí)以及幾乎所有的臟器功能均會(huì)產(chǎn)生不同程度的影響。腦缺血損傷后的神經(jīng)炎癥往往貫穿缺血再灌注損傷病理發(fā)展的全過(guò)程,強(qiáng)烈的神經(jīng)炎癥反應(yīng)造成的腦繼發(fā)性損傷是目前臨床上非常棘手的問(wèn)題,因而抑制腦內(nèi)神經(jīng)炎癥將會(huì)為腦中風(fēng)患者的治療和預(yù)后帶來(lái)曙光。小膠質(zhì)細(xì)胞作為腦內(nèi)免疫細(xì)胞的代表,其在神經(jīng)炎癥中的功能變化受到人們的廣泛關(guān)注。在缺血再灌注損傷的不同時(shí)期,小膠質(zhì)細(xì)胞的功能持續(xù)發(fā)生變化。經(jīng)典激活狀態(tài)(M1 phenotype)的小膠質(zhì)細(xì)胞在炎癥早期釋放大量炎癥因子及氧自由基等有害物質(zhì),破壞神經(jīng)元結(jié)構(gòu)的完整性和功能的穩(wěn)定性;而選擇性激活狀態(tài)(M2 phenotype)的小膠質(zhì)細(xì)胞則在炎癥晚期分泌一些神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)物質(zhì),清除壞死或凋亡的神經(jīng)元碎片,促進(jìn)組織膠質(zhì)瘢痕的形成以及營(yíng)養(yǎng)神經(jīng)元。因而調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞的功能活化狀態(tài)使其趨利避害,減輕腦內(nèi)神經(jīng)炎癥,控制疾病的發(fā)生發(fā)展,將是防治缺血后神經(jīng)損傷的新目標(biāo)。II型髓樣細(xì)胞激發(fā)受體(TREM2)是高表達(dá)于小膠質(zhì)細(xì)胞上的一種免疫球蛋白樣受體,它在自身免疫及炎癥過(guò)程中發(fā)揮“負(fù)性調(diào)節(jié)”的有益作用。那么TREM2是不是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵靶點(diǎn)?調(diào)控TREM2的表達(dá)能否改善腦缺血損傷后的神經(jīng)功能?針對(duì)這些科學(xué)問(wèn)題,我們通過(guò)體內(nèi)、體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)了上調(diào)TREM2的表達(dá)可促使小膠質(zhì)細(xì)胞由M1型向M2型轉(zhuǎn)變減輕神經(jīng)炎癥,改善缺血后神經(jīng)功能,初步闡明TREM2是調(diào)控小膠質(zhì)細(xì)胞活化狀態(tài)的重要信號(hào)分子,有助于缺血性腦中風(fēng)新型治療手段和藥物的研發(fā)。實(shí)驗(yàn)一:不同功能活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2的表達(dá)【目的】觀察TREM2在M1和M2兩種不同功能活化狀態(tài)小膠質(zhì)細(xì)胞中的表達(dá),初步明確其與M1和M2活化狀態(tài)的關(guān)系。【方法】采用LPS/IFN-γ定向誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)化,L-4/IL-13定向誘導(dǎo)原代小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)化,應(yīng)用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)M1標(biāo)記物i NOS、M2標(biāo)記物Arg-1以及TREM2的表達(dá)�！窘Y(jié)果】LPS/IFN-γ組i NOS表達(dá)較control組多(P0.05),而IL-4/IL-13組Arg-1表達(dá)較control組多(P0.05),初步將小膠質(zhì)細(xì)胞按功能狀態(tài)區(qū)分開(kāi)來(lái),進(jìn)而發(fā)現(xiàn)TREM2在IL-4/IL-13組表達(dá)升高,且與control組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。免疫熒光雙標(biāo)染色結(jié)果與Western Blot近乎一致�！窘Y(jié)論】TREM2在M2型小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)升高,而在M1型小膠質(zhì)細(xì)胞上表達(dá)降低。實(shí)驗(yàn)二:腦缺血損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2的表達(dá)【目的】觀察腦缺血后再灌注不同時(shí)間點(diǎn)小膠質(zhì)細(xì)胞M1型和M2型標(biāo)記物的變化及TREM2的表達(dá)情況�！痉椒ā繉�27只SPF級(jí)雄性C57BL/6小鼠分為Sham組和MCAO組,其中MCAO組小鼠再次隨機(jī)分為4組,即構(gòu)建MCAO動(dòng)物模型后,于再灌注后的6h,24h,3d和7d分別取缺血半暗帶腦組織(n=6),應(yīng)用Western Blot和免疫熒光染色方法檢測(cè)并觀察梗死同側(cè)區(qū)半暗帶腦組織中i NOS、IL-6、Arg-1、BDNF及TREM2的表達(dá)。【結(jié)果】再灌注后6h,i NOS的表達(dá)最高(P0.01),同樣在6h這一時(shí)間點(diǎn)也觀察到IL-6的表達(dá)增加(P0.001),M1型標(biāo)記物i NOS、IL-6在6h、24h均較對(duì)照組升高,M2型小標(biāo)記物Arg-1和BDNF于再灌注后7d表達(dá)最高(P0.001)。TREM2的表達(dá)隨缺血再灌注時(shí)間的延長(zhǎng)而逐漸增高,在3d表達(dá)最高(P0.001)。【結(jié)論】腦缺血損傷后早期以M1型小膠質(zhì)細(xì)胞為主,腦缺血損傷后晚期以M2型小膠質(zhì)細(xì)胞為主,TREM2在缺血再灌注后3d即M1/M2過(guò)渡期表達(dá)最高。實(shí)驗(yàn)三:下調(diào)TREM2的表達(dá)對(duì)腦缺血損傷的影響【目的】探討下調(diào)TREM2的表達(dá)后對(duì)腦梗死容積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、神經(jīng)元凋亡的影響�！痉椒ā啃坌訡57BL/6小鼠24只分為以下3組:MCAO組、si RNA組、scr RNA組,其中MCAO組處理方法同前;si RNA組、scr RNA組:側(cè)腦室注射TREM2-si RNA、control si RNA,72 h后構(gòu)建MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1 h后再灌注。缺血再灌注后3d取腦組織,通過(guò)TTC染色、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(Longa評(píng)分)、TUNEL染色的方法對(duì)腦功能進(jìn)行評(píng)估�！窘Y(jié)果】TUNEL染色結(jié)果顯示TREM2-si RNA組與MCAO組相比,神經(jīng)元凋亡數(shù)目明顯增多(P0.05),但TREM2-si RNA組的小鼠腦梗死容積和神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分與MCAO組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異�！窘Y(jié)論】下調(diào)TREM2的表達(dá)后加重神經(jīng)元的凋亡。實(shí)驗(yàn)四:上調(diào)TREM2的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用【目的】探討上調(diào)TREM2的表達(dá)后對(duì)腦梗死容積、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分、神經(jīng)元凋亡的影響�！痉椒ā繉�32只雄性C57BL/6小鼠分為4組:MCAO組、Hsp60 2.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp60 5μg組,其中MCAO組處理方法同前;Hsp60 2.5μg組、Hsp603.75μg組、Hsp60 5μg組:腹腔注射Hsp60藥物1h后開(kāi)始構(gòu)建MCAO模型;同樣,將雄性C57BL/6小鼠24只分為Sham組、MCAO組、LV+MCAO組,其中LV+MCAO組:側(cè)腦室注射TREM2-過(guò)表達(dá)慢病毒,于10d后構(gòu)建MCAO模型,大腦中動(dòng)脈缺血1 h后再灌,再灌注后3d取材,通過(guò)TTC染色、神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分(Longa評(píng)分)、TUNEL染色的方法評(píng)估腦功能。【結(jié)果】Hsp60 5μg組與MCAO組相比,神經(jīng)行為學(xué)評(píng)分以及腦梗死容積減少均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.001),TUNEL染色表明Hsp60 3.75μg組、Hsp60 5μg組與MCAO組相比,凋亡細(xì)胞數(shù)量有所減少(P0.01)。LV+MCAO組與MCAO組相比,腦梗死容積有所減少(P0.05),M1標(biāo)記物i NOS表達(dá)降低(P0.01)而M2標(biāo)記物Arg-1表達(dá)升高(P0.001)�！窘Y(jié)論】Hsp60激活TREM2的表達(dá),能夠改善缺血再灌注后神經(jīng)功能,從而發(fā)揮腦保護(hù)作用;TREM2-過(guò)表達(dá)慢病毒上調(diào)TREM2的表達(dá),同樣發(fā)揮腦保護(hù)作用。實(shí)驗(yàn)五:慢病毒調(diào)控TREM2的表達(dá)對(duì)氧糖剝奪模型后小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)的影響【目的】進(jìn)一步在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中驗(yàn)證調(diào)控TREM2的表達(dá)能夠改變?nèi)毖笮∧z質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)�！痉椒ā繉9小膠質(zhì)細(xì)胞分為以下三組,control-vector組、TREM2-vector組、TREM2-si RNA組,慢病毒轉(zhuǎn)染3d后將細(xì)胞給予氧糖剝奪模型處理4h,隨后復(fù)糖復(fù)氧24h,接著收集細(xì)胞并提取細(xì)胞蛋白用Western Blot的方法檢測(cè)i NOS、IL-6、BDNF、Arg-1的表達(dá)情況�！窘Y(jié)果】TREM2-vector組與control-vector組相比,M2標(biāo)記物BDNF、Arg-1的表達(dá)均較對(duì)照組升高,且存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);TREM2-si RNA組i NOS、IL-6表達(dá)較control-vector組增加高(P0.001)�！窘Y(jié)論】上調(diào)TREM2的表達(dá)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M2型轉(zhuǎn)變,而下調(diào)TREM2表達(dá)促進(jìn)小膠質(zhì)細(xì)胞向M1型轉(zhuǎn)變。
【關(guān)鍵詞】：TREM2 神經(jīng)炎癥 小膠質(zhì)細(xì)胞活化 腦缺血再灌注損傷
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R743.3
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-17
• 前言17-19
• 文獻(xiàn)回顧19-30
• 實(shí)驗(yàn)一 不同功能活化狀態(tài)的小膠質(zhì)細(xì)胞中TREM2 的表達(dá)30-42
• 1 材料30-33
• 2 方法33-36
• 3 結(jié)果36-40
• 4 討論40-42
• 實(shí)驗(yàn)二 腦缺血損傷后小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)的變化及TREM2 的表達(dá)42-51
• 1 材料42-43
• 2 方法43-46
• 3 結(jié)果46-49
• 4 討論49-51
• 實(shí)驗(yàn)三 下調(diào)TREM2 的表達(dá)對(duì)腦缺血損傷的影響51-57
• 1 材料51
• 2 方法51-54
• 3 結(jié)果54-56
• 4 討論56-57
• 實(shí)驗(yàn)四 上調(diào)TREM2 的表達(dá)發(fā)揮腦保護(hù)作用57-62
• 1 材料57
• 2 方法57-58
• 3 結(jié)果58-61
• 4 討論61-62
• 實(shí)驗(yàn)五 慢病毒調(diào)控TREM2 的表達(dá)對(duì)氧糖剝奪模型后小膠質(zhì)細(xì)胞功能活化狀態(tài)的影響62-66
• 1 材料62
• 2 方法62-63
• 3 結(jié)果63-65
• 4 討論65-66
• 小結(jié)66-67
• 參考文獻(xiàn)67-74
• 附錄74-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果76-77
• 致謝77-78

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本文編號(hào)：1049690