本文關(guān)鍵詞：組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的研究

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【摘要】：神經(jīng)母細(xì)胞瘤(neuroblastoma,NB)來(lái)源于交感神經(jīng)系統(tǒng),是一種常見(jiàn)的小兒顱外實(shí)體外周神經(jīng)系統(tǒng)惡性腫瘤,占兒童腫瘤發(fā)生率的8%~10%以及兒童癌癥死亡的15%。神經(jīng)母細(xì)胞瘤從良性神經(jīng)元到形成腫瘤的過(guò)程都具有異質(zhì)性,其較強(qiáng)的增殖和轉(zhuǎn)移能力是導(dǎo)致患者死亡的主要因素。其中,60%患兒初步診斷時(shí)年齡大于1歲,45%患兒在發(fā)現(xiàn)時(shí)已經(jīng)有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床表現(xiàn)各不相同,在晚期的病人中通常會(huì)發(fā)現(xiàn)其對(duì)包括手術(shù)、化療和放療等傳統(tǒng)的治療方法具有很強(qiáng)的抗性。因此,近年來(lái)大量的實(shí)驗(yàn)致力于探索針對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的新的治療手段。SMYD3(SET and MYND domain-containing protein 3)是近幾年新發(fā)現(xiàn)的一種組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶。研究表明,SMYD3在肝癌、乳腺癌、胃癌、結(jié)腸癌等癌癥組織或細(xì)胞中高表達(dá),而在相應(yīng)正常組織中低表達(dá)甚至檢測(cè)不到,這說(shuō)明SMYD3與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有緊密的聯(lián)系。本研究通過(guò)探究SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和成瘤作用,以期能為神經(jīng)母細(xì)胞瘤的治療提供新的思路。本文首次揭示SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的增殖和凋亡過(guò)程的重要作用,基于腫瘤臨床預(yù)后數(shù)據(jù)庫(kù)的分析發(fā)現(xiàn),SMYD3可以顯著影響神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后狀況,同時(shí)檢測(cè)了SMYD3在不同神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平。通過(guò)在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系BE(2)-C和SHEP1中進(jìn)行SMYD3敲低和恢復(fù)表達(dá)實(shí)驗(yàn),檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖以及周期和凋亡的影響,探索其對(duì)細(xì)胞增殖的調(diào)控作用。實(shí)驗(yàn)的主要的結(jié)果如下:1.組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤患者的預(yù)后影響及其表達(dá)分析通過(guò)分析神經(jīng)母細(xì)胞瘤的預(yù)后數(shù)據(jù)庫(kù)Versteeg,發(fā)現(xiàn)SMYD3高水平表達(dá)的患者的生存率明顯低于低表達(dá)的患者,且SMYD3的表達(dá)水平與腫瘤患者的腫瘤等級(jí)、患病年齡等顯著相關(guān),這表明SMYD3可能與神經(jīng)母細(xì)胞瘤的惡性程度有一定關(guān)系。通過(guò)熒光定量PCR和Western blot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)SMYD3在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)水平,結(jié)果表明SMYD3在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中普遍表達(dá),并且與腫瘤的惡性程度相關(guān)。2.SMYD3促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)為了探究SMYD3促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤惡性增殖的機(jī)理,我們用慢病毒包裝SMYD3的干涉和過(guò)表達(dá)載體后感染人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系,用嘌呤霉素篩選獲得穩(wěn)定細(xì)胞系,從而檢測(cè)SMYD3表達(dá)水平改變對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的影響。細(xì)胞增殖曲線和BrdU標(biāo)記實(shí)驗(yàn)顯示,干涉SMYD3明顯抑制了細(xì)胞的體外增殖能力。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)分析細(xì)胞周期分布發(fā)現(xiàn),SMYD3干涉的BE(2)C和SHEP1細(xì)胞的S期比例明顯減少,而過(guò)表達(dá)SMYD3細(xì)胞的S期比例增加。Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),干涉SMYD3表達(dá)后,G1/S期周期蛋白CDK2和cyclinE的表達(dá)明顯受到抑制。通過(guò)建立小鼠皮下成瘤動(dòng)物模型,發(fā)現(xiàn)干涉SMYD3后細(xì)胞的成瘤能力降低,而過(guò)表達(dá)恢復(fù)后細(xì)胞的成瘤能力得到了一定程度的提升。軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)得出,SMYD3干涉的BE(2)C和SHEP1細(xì)胞形成的克隆不僅數(shù)量減少,而且體積縮小。這些結(jié)果表明,SMYD3能夠促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的生長(zhǎng),所以針對(duì)SMYD3的靶向治療有望起到干擾神經(jīng)母細(xì)胞瘤進(jìn)一步發(fā)展的作用。3.SMYD3通過(guò)抑制P53/P21途徑來(lái)促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)通過(guò)查閱文獻(xiàn)發(fā)現(xiàn),在胃癌細(xì)胞中SMYD3可能通過(guò)抑制p53的蛋白水平來(lái)促進(jìn)細(xì)胞的增殖,故采用Western blot檢測(cè)SMYD3干涉對(duì)p53和p21的蛋白水平影響,并進(jìn)行SMYD3表達(dá)恢復(fù)實(shí)驗(yàn)。在BE(2)C和SHEP1細(xì)胞系中干涉SMYD3表達(dá)引起p53和p21水平升高,而在SMYD3干涉的細(xì)胞感染過(guò)表達(dá)SMYD3的慢病毒時(shí),SMYD3含量有一定程度的恢復(fù),原先升高的p53/p21水平有所降低。Real-time RT-PCR和Western blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn),當(dāng)干涉SMYD3表達(dá)時(shí),p53的經(jīng)典泛素化蛋白MDM2未變化,而泛素化蛋白酶TRIM24表達(dá)水平下調(diào);恢復(fù)表達(dá)SMYD3后,TRIM24表達(dá)隨之上調(diào),而MDM2未變化。這些結(jié)果說(shuō)明,SMYD3對(duì)p53的調(diào)控是通過(guò)TRIM24來(lái)介導(dǎo)的,而不是MDM2;SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的促進(jìn)作用可能是由TRIIM24介導(dǎo)的p53/p21信號(hào)通路所介導(dǎo)。綜上所述,SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)增殖以及成瘤具有重要作用,本研究結(jié)果為SMYD3作為腫瘤的標(biāo)記物提供了重要依據(jù),也豐富了神經(jīng)母細(xì)胞瘤分子治療的理論基礎(chǔ)。
【關(guān)鍵詞】：組蛋白甲基化 SMYD3 神經(jīng)母細(xì)胞瘤 p53 細(xì)胞增殖
【學(xué)位授予單位】：西南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.4
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-15
• 第一章 文獻(xiàn)綜述15-21
• 1.1 表觀遺傳學(xué)15-17
• 1.1.1 表觀遺傳學(xué)概述15
• 1.1.2 DNA甲基化15-16
• 1.1.3 組蛋白修飾16
• 1.1.4 染色質(zhì)重塑16-17
• 1.1.5 小的非編碼RNA17
• 1.2 組蛋白甲基化轉(zhuǎn)移酶SMYD317-21
• 1.2.1 SMYD3概述17-18
• 1.2.2 SMYD3的結(jié)構(gòu)與功能18
• 1.2.3 SMYD3與癌癥的關(guān)系18-19
• 1.2.4 SMYD3的下游靶基因研究19-21
• 第二章 引言21-23
• 2.1 研究背景、目的及意義21
• 2.2 研究?jī)?nèi)容及技術(shù)路線21-23
• 2.2.1 研究?jī)?nèi)容21-22
• 2.2.2 技術(shù)路線22-23
• 第三章 SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床意義及其表達(dá)分析23-35
• 3.1 材料和試劑儀器23-26
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料23
• 3.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器23-24
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑24
• 3.1.4 溶液配制24-26
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法26-31
• 3.2.1 臨床數(shù)據(jù)分析26
• 3.2.2 細(xì)胞培養(yǎng)26-27
• 3.2.3 cDNA模板的準(zhǔn)備27-28
• 3.2.4 熒光定量PCR28-29
• 3.2.5 總蛋白的提取29-30
• 3.2.6 Western Blot檢測(cè)目的蛋白30-31
• 3.2.7 免疫熒光染色31
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析31-33
• 3.3.1 數(shù)據(jù)庫(kù)分析結(jié)果31-33
• 3.3.2 SMYD3在神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系中的表達(dá)33
• 3.4 討論與小結(jié)33-35
• 3.4.1 討論33-34
• 3.4.2 小結(jié)34-35
• 第四章 SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的影響35-45
• 4.1 材料和試劑儀器35-36
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料35
• 4.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑35
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器35-36
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法36-38
• 4.2.1 慢病毒感染細(xì)胞36
• 4.2.2 BrdU染色36
• 4.2.3 免疫熒光染色36-37
• 4.2.4 Soft Agar實(shí)驗(yàn)37
• 4.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)37-38
• 4.3 結(jié)果和討論38-43
• 4.3.1 干涉SMYD3對(duì)細(xì)胞增殖的影響38-41
• 4.3.2 SMYD3恢復(fù)實(shí)驗(yàn)41-43
• 4.4 討論與小結(jié)43-45
• 第五章 SMYD3對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響45-53
• 5.1 材料和試劑儀器45-46
• 5.1.1 實(shí)驗(yàn)材料45
• 5.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑45
• 5.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器45
• 5.1.4 主要的抗體45-46
• 5.2 實(shí)驗(yàn)方法46
• 5.2.1 細(xì)胞周期分析46
• 5.2.2 周期相關(guān)蛋白水平的檢測(cè)46
• 5.3 結(jié)果與分析46-51
• 5.3.1 細(xì)胞周期變化46-48
• 5.3.2 細(xì)胞周期蛋白表達(dá)的變化48-50
• 5.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)50-51
• 5.4 討論與小結(jié)51-53
• 5.4.1 討論51-52
• 5.4.2 小結(jié)52-53
• 第六章 SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響53-59
• 6.1 材料和試劑儀器53-54
• 6.1.1 實(shí)驗(yàn)材料53
• 6.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑53
• 6.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器53
• 6.1.4 主要的抗體53-54
• 6.2 實(shí)驗(yàn)方法54
• 6.2.1 慢病毒感染細(xì)胞54
• 6.2.2 細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白的檢測(cè)54
• 6.3 結(jié)果與分析54-56
• 6.3.1 SMYD3對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖相關(guān)信號(hào)通路的影響54-55
• 6.3.2 SMYD3影響P53泛素化蛋白TRIM24的表達(dá)55-56
• 6.4 討論與小結(jié)56-59
• 6.4.1 泛素化修飾系統(tǒng)與TRIM2456-57
• 6.4.2 小結(jié)57-59
• 第七章 TRIM24干涉和過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建59-69
• 7.1 材料和儀器59-60
• 7.1.1 實(shí)驗(yàn)材料59
• 7.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑59-60
• 7.1.3 主要溶液配制60
• 7.1.4 實(shí)驗(yàn)儀器60
• 7.2 實(shí)驗(yàn)方法60-62
• 7.2.1 TRIM24全長(zhǎng)目的片段的擴(kuò)增60
• 7.2.2 目的片段的回收60-61
• 7.2.3 目的片段與載體的連接61
• 7.2.4 轉(zhuǎn)化61
• 7.2.5 篩選陽(yáng)性克隆61
• 7.2.6 測(cè)序及比對(duì)61
• 7.2.7 目的基因和過(guò)表達(dá)載體的酶切61
• 7.2.8 載體片段的回收及去磷酸化61-62
• 7.2.9 載體與目的基因的連接62
• 7.2.10 重復(fù)步驟 6.3.6.4 和 6.3.6.562
• 7.2.11 酶切驗(yàn)證62
• 7.3 結(jié)果與分析62-66
• 7.3.1 TRIM24過(guò)表達(dá)載體的構(gòu)建62-64
• 7.3.2 TRIM24干涉載體的構(gòu)建64-66
• 7.4 討論與小結(jié)66-69
• 7.4.1 討論66-67
• 7.4.2 小結(jié)67-69
• 第八章 SMYD3對(duì)基因TRIM24的調(diào)控研究69-79
• 8.1 材料和試劑儀器69-70
• 8.1.1 實(shí)驗(yàn)材料69
• 8.1.2 實(shí)驗(yàn)試劑69
• 8.1.3 實(shí)驗(yàn)儀器69-70
• 8.2 實(shí)驗(yàn)方法70-72
• 8.2.1 TRIM24的數(shù)據(jù)庫(kù)分析70
• 8.2.2 TRIM24在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤中的表達(dá)譜分析70
• 8.2.3 慢病毒包裝、感染及鑒定70-71
• 8.2.4 慢病毒感染細(xì)胞(見(jiàn) 4.2.3)71
• 8.2.5 MTT實(shí)驗(yàn)71
• 8.2.6 免疫熒光染色71-72
• 8.2.7 細(xì)胞周期分析72
• 8.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與分析72-77
• 8.3.1 R2數(shù)據(jù)平臺(tái)Versteeg數(shù)據(jù)庫(kù)的分析結(jié)果72-74
• 8.3.2 TRIM24基因在神經(jīng)母細(xì)胞瘤和膠質(zhì)瘤中普遍表達(dá)74
• 8.3.3 TRIM24促進(jìn)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖74-75
• 8.3.4 TRIM24的下游信號(hào)通路檢測(cè)75-76
• 8.3.5 TRIM24能夠部分挽救shSMYD3細(xì)胞系的增殖76-77
• 8.4 討論與小結(jié)77-79
• 8.4.1 討論77-78
• 8.4.2 小結(jié)78-79
• 第九章 全文總結(jié)79-81
• 參考文獻(xiàn)81-85
• 縮略詞表85-87
• 致謝87-89
• 碩士在讀期間發(fā)表的文章及參研課題情況89

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1 吳凱;miR-483-3p對(duì)人神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖、凋亡、侵襲及遷移的影響及作用機(jī)制研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

2 田培超;靶向MYCN干擾穩(wěn)轉(zhuǎn)株的構(gòu)建及聯(lián)合TAE684對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生物學(xué)行為的影響[D];鄭州大學(xué);2014年

3 支運(yùn)來(lái);NF-κB信號(hào)通路介導(dǎo)的神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖及侵襲、轉(zhuǎn)移的實(shí)驗(yàn)研究[D];青島大學(xué);2015年

4 于芳;應(yīng)用蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)篩選神經(jīng)母細(xì)胞瘤自行消退相關(guān)蛋白[D];中國(guó)人民解放軍軍醫(yī)進(jìn)修學(xué)院;2010年

5 鄭繼翠;環(huán)境內(nèi)分泌干擾物對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤生長(zhǎng)的影響[D];復(fù)旦大學(xué);2006年

6 劉海燕;Astrocyte elevated Gene-1在神經(jīng)母細(xì)胞瘤中的表達(dá)及基因沉默對(duì)細(xì)胞生物學(xué)行為的影響[D];山東大學(xué);2009年

7 蔡煒嵩;伊立替康聯(lián)合環(huán)磷酰胺節(jié)律性化療治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤療效及機(jī)制研究[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2009年

8 鹿洪亭;神經(jīng)母細(xì)胞瘤裸鼠模型建立及miRNAs與神經(jīng)母細(xì)胞瘤轉(zhuǎn)移機(jī)制研究[D];青島大學(xué);2010年

9 彭鯤鵬;維甲酸誘導(dǎo)神經(jīng)母細(xì)胞瘤分化的蛋白質(zhì)組學(xué)研究[D];中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2005年

10 談衛(wèi)強(qiáng);青蒿素抑制神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞增殖的機(jī)制研究[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 劉娜;神經(jīng)母細(xì)胞瘤36例臨床分析[D];中國(guó)醫(yī)科大學(xué);2010年

2 高喜偉;神經(jīng)母細(xì)胞瘤38例臨床分析[D];鄭州大學(xué);2012年

3 李吉馥;組蛋白賴氨酸甲基化轉(zhuǎn)移酶SETDB1及其下游因子對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖分化的影響及機(jī)制研究[D];西南大學(xué);2016年

4 張維博;組蛋白甲基轉(zhuǎn)移酶SMYD3調(diào)控神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的研究[D];西南大學(xué);2016年

5 蔡在欣;從厥陰、中氣治療神經(jīng)母細(xì)胞瘤化療不良反應(yīng)的臨床研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2016年

6 張旺;~(125)I粒子植入術(shù)治療荷神經(jīng)母細(xì)胞瘤裸鼠有效性和安全性的實(shí)驗(yàn)研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

7 譚正蘭;miR-221促進(jìn)N-myc表達(dá)對(duì)神經(jīng)母細(xì)胞瘤增殖的作用與機(jī)制研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2016年

8 袁妙賢;小兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤蛋白質(zhì)組的初步探索[D];中國(guó)人民解放軍醫(yī)學(xué)院;2012年

9 高建;80例神經(jīng)母細(xì)胞瘤的臨床診治療效及預(yù)后影響因素分析[D];鄭州大學(xué);2013年

10 宋澤南;嬰兒神經(jīng)母細(xì)胞瘤13例臨床分析[D];廣西醫(yī)科大學(xué);2014年

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本文編號(hào)：1034359