本文關(guān)鍵詞：脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)兩個家系的分子遺傳學(xué)研究

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【摘要】：[目的 ]1.調(diào)查分析兩個家系的家系成員患病情況,繪制完整的家系圖譜,明確家系內(nèi)各患病成員之間的關(guān)系。2.明確兩個家系所患疾病及疾病亞型,獲知疾病累及范圍及嚴(yán)重程度,為家系成員提供關(guān)于所患疾病的詳細(xì)資料。3.明確導(dǎo)致這兩個家系SCAs的致病基因,了解家系中癥狀前人員攜帶致病基因情況。4.分析致病基因致病的特點,為豐富和完善我國脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)(spinocerebellar ataxias,SCAs)研究提供更多的參考資料。[內(nèi)容]1.調(diào)查兩個遺傳性SCAs家系成員發(fā)病情況,繪制家系遺傳圖譜。2.對兩個遺傳性SCAs家系先證者進(jìn)行詳細(xì)的神經(jīng)系統(tǒng)檢查,明確診斷。3.采用外顯子捕獲及二代測序技術(shù),對兩個遺傳性SCAs家系中已經(jīng)確定發(fā)病的患者的外周靜脈血基因組DNA突變情況進(jìn)行分析。4.通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(Polymerase Chain Reaction,PCR),瓊脂糖凝膠電泳和直接測序的方法對外顯子測序獲得的突變基因進(jìn)行驗證,明確致病基因,分析研究其致病特點及分子機(jī)制。[方法]1.本研究中的甘肅省家族遺傳性神經(jīng)系統(tǒng)疾病家系的先證者Ⅲ-7最初在甘肅省臨夏州人民醫(yī)院進(jìn)行核磁共振掃描,初步診斷為腦萎縮,以小腦萎縮為著,后來結(jié)合先證者Ⅲ-7及其弟弟Ⅲ-5的臨床學(xué)表現(xiàn)、影像學(xué)檢查、家族遺傳史等,在北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科被診斷為SCAs,臨床診斷符合Harding標(biāo)準(zhǔn)。2.獲知甘肅省渭源縣患病家系的相關(guān)情況后,課題組成員先后兩次遠(yuǎn)赴甘肅省渭源縣進(jìn)行詳細(xì)的家系情況和家族遺傳史調(diào)查,獲得家系成員的知情與同意,并邀請先證者Ⅲ-7及其弟弟Ⅲ-5親赴北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科進(jìn)行診斷,臨床診斷為SCAs。3.本研究中的河北-遼寧地區(qū)SCAs家系的先證者(Ⅲ-9)在北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科確診為SCAs,初步篩查排除了幾種常見亞型的可能性,因此懷疑是一種新的亞型。4.獲知河北-遼寧地區(qū)患病家系的相關(guān)情況后,課題組成員邀請家系成員Ⅲ-5和Ⅲ-11親赴北京大學(xué)第三醫(yī)院神經(jīng)內(nèi)科進(jìn)行診斷,臨床診斷為SCAs。5.在患者及其家族成員知情同意的情況下,詳細(xì)講解該疾病的致病原因及危害,以及對于家族后代的危害性,填寫調(diào)查表和知情同意書,并對家系成員進(jìn)行自愿性的外周靜脈血抽取,各抽取5 m L外周靜脈血,并放置于EDTA(Ethylenediaminetetraacetic acid,乙二胺四乙酸)抗凝管中,按調(diào)查表上的序列號做好標(biāo)記,凍存于本室-80℃的超低溫冰箱內(nèi)。按照外顯子測序?qū)τ跇悠返囊?將兩個家系處理好的樣品各兩份送由深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行外顯子捕獲及二代測序,按要求提取兩個家系內(nèi)收集到血液樣品的所有成員的基因組DNA(Deoxyribonucleic acid,脫氧核糖核酸),凍存于本室-80℃的超低溫冰箱內(nèi)用于后續(xù)實驗。6.對于兩個家系患者的外顯子測序結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計和分析,分別得出家系患者共有突變基因,并設(shè)計引物,進(jìn)行PCR擴(kuò)增驗證,對PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測,對于符合直接測序要求的樣品送由生工生物工程(上海)股份有限公司進(jìn)行測序,對于不符合測序要求的重新設(shè)計引物驗證,最終篩出與兩個家系所患疾病相關(guān)的致病基因,獲知疾病的基因亞型,分析研究致病機(jī)制,為后續(xù)做出癥狀前診斷提供依據(jù)。[結(jié)果]1.對于甘肅省渭源縣SCAs家系,在深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行外顯子測序的兩位患者Ⅲ-5和Ⅱ-8的測序結(jié)果與人類基因組參考序列(UCSC hg 19 version)比對,兩位患者相同的突變?yōu)?4個點突變位點和8個插入缺失突變基因。結(jié)合臨床診斷結(jié)果,首先選取8個插入缺失突變基因中的ATXN2基因進(jìn)行PCR驗證。最終確定該家系為CAG三核苷酸重復(fù)序列動態(tài)突變引起的常染色體顯性遺傳性脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)Ⅱ型(spinocerebellar ataxias type 2,SCA 2),基因診斷還發(fā)現(xiàn)該家系中有7名致病等位基因攜帶者。2.對于甘肅省渭源縣SCA2家系,對46位家系成員進(jìn)行了突變基因ATXN2的檢測,PCR擴(kuò)增檢測基因內(nèi)CAG三核苷酸的重復(fù)次數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)家系中的6例患者Ⅱ-8、Ⅲ-5、Ⅲ-7、Ⅲ-21、Ⅳ-8、Ⅳ-10及7例致病等位基因攜帶者Ⅲ-13、Ⅳ-1、Ⅳ-6、Ⅳ-19、Ⅴ-1、Ⅴ-3、Ⅴ-5的PCR產(chǎn)物電泳圖的電泳條帶上出現(xiàn)了明顯的2條大小不等的條帶,而家系中其他成員未出現(xiàn)該現(xiàn)象。這是因為理論上針對這一位點而言,每個個體PCR產(chǎn)物都是兩個條帶(一對等位基因),正常人兩條等位基因的CAG重復(fù)次數(shù)相同或者差距較小,在電泳圖上無法區(qū)分,但是患者和攜帶者的PCR產(chǎn)物的正常等位基因明顯比異常等位基因小,在電泳圖上可分辨出來。根據(jù)測序結(jié)果計數(shù)致病基因ATXN2的CAG(反向為CTG)三核苷酸重復(fù)次數(shù),結(jié)果顯示患者及致病等位基因攜帶者異常等位基因的CAG重復(fù)次數(shù)為40~48次,明顯超出正常范圍(13~31次),剩余家系成員突變基因ATXN2的兩條等位基因的CAG重復(fù)次數(shù)均在19~25次,屬于正常范圍。3.對于河北-遼寧地區(qū)SCAs家系,在深圳華大基因科技有限公司進(jìn)行外顯子測序的兩位患者Ⅲ-5和Ⅲ-11的測序結(jié)果與人類基因組參考序列(UCSC hg 19 version)比對,兩位患者相同的突變?yōu)?5個點突變位點。初步篩查出5個基因(即FERMT1,S100A12,SPATC1,SPTB,ZNF334)可能與該家系的SCAs相關(guān),,暫時無法明確為哪種亞型,需要后續(xù)繼續(xù)研究分析。[結(jié)論]1.本研究中的兩個遺傳性SCAs家系患者臨床癥狀上均表現(xiàn)出行走不穩(wěn)伴持物不穩(wěn),步態(tài)失調(diào),飲水嗆咳,輕度構(gòu)音障礙,指鼻及跟-膝-脛試驗欠穩(wěn)妥,輪替障礙,辨距不良等;頭部MRI(Magnetic Resonance Imaging,核磁共振成像)檢查顯示腦萎縮,以小腦萎縮為著;肌電圖檢查提示肌張力障礙和腱反射減弱。兩個家系患者的臨床癥狀均符合SCAs的典型癥狀,但不同患者的臨床表現(xiàn)和同一位患者在不同患病階段得臨床表現(xiàn)存在明顯差異,即存在明顯的臨床和遺傳異質(zhì)性。2.對于診斷為SCA2(Spinocerebellar ataxia type 2)的甘肅省患病家系,家系成員之間不存在明顯的遺傳早現(xiàn)現(xiàn)象,且患者均不存在智力障礙,這與部分報道不一致。3.初步診斷為SCAs的河北-遼寧患病家系,初步篩查出5個候選基因,即FERMT1,S100A12,SPATC1,SPTB,ZNF334,可能與該家系的SCAs相關(guān),但還需要進(jìn)一步研究分析。4.SCAs的明確診斷和分型不能僅僅依靠臨床診斷,因為SCAs具有高度的臨床和遺傳異質(zhì)性,且各亞型之間有不少重疊癥狀,必須結(jié)合基因診斷。
【關(guān)鍵詞】：家系圖譜 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào) 聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng) 外顯子測序 致病基因
【學(xué)位授予單位】：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R744.7
【目錄】：

• 縮略詞表4-5
• 中文摘要5-8
• Abstract8-12
• 前言12-15
• 第一章 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)兩個家系的患病情況調(diào)查與臨床診斷15-24
• 1. 家系成員患病情況調(diào)查15-16
• 2. 家系患者臨床診斷16
• 3. 家系成員患病情況調(diào)查與臨床診斷結(jié)果16-22
• 4. 討論22-24
• 第二章 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)兩個家系患者的外顯子測序與分析24-32
• 1. 方法與內(nèi)容25
• 2. 外顯子測序數(shù)據(jù)分析(以河北-遼寧SCAs家系為例)25-28
• 3. 結(jié)果28-30
• 4. 討論30-32
• 第三章 脊髓小腦性共濟(jì)失調(diào)兩個家系相關(guān)人員的基因檢測32-43
• 1. 方法與內(nèi)容32-36
• 2. 結(jié)果36-42
• 3. 結(jié)論42-43
• 討論43-47
• 1. 甘肅省SCAs家系患病情況分析與討論43-45
• 2. 河北-遼寧SCAs家系患病情況分析與討論45-46
• 3. 問題與展望46-47
• 結(jié)論47-48
• 參考文獻(xiàn)48-52
• 個人簡歷52-53
• 致謝53-54

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