本文關(guān)鍵詞：基于聚谷氨酸構(gòu)象轉(zhuǎn)變構(gòu)建納米靶向復(fù)合膠束及其抗黑色素瘤研究

  更多相關(guān)文章： 聚合谷氨酸 構(gòu)象轉(zhuǎn)變 鹽酸阿霉素 Tat肽 A375人黑色素瘤細(xì)胞 惡性黑色素瘤

【摘要】：本文應(yīng)用構(gòu)象可變的聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物和Tat肽修飾的聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物構(gòu)建了納米靶向復(fù)合膠束。通過自組裝方式,借助鹽酸阿霉素與復(fù)合膠束內(nèi)核高分子材料鏈段間的相互作用實現(xiàn)載藥,并將載藥復(fù)合膠束用于抗黑色素瘤研究。已有研究發(fā)現(xiàn)Tat肽具有較強(qiáng)的跨膜遞送能力,但其作用方式缺乏靶向性。此外,Tat肽酶解穩(wěn)定性差,酶解后跨膜遞送能力顯著降低。為了解決上述問題,本文合成了構(gòu)象可變的聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物。在血液循環(huán)中,聚谷氨酸鏈段可以屏蔽Tat肽的跨膜遞送功能,防止其針對正常細(xì)胞發(fā)揮跨膜遞送作用。同時,這種屏蔽作用還可以保護(hù)Tat肽,防止其被酶解,失去跨膜遞送活性。腫瘤(實體瘤)組織特有的EPR效應(yīng)可增加藥物載體在瘤體內(nèi)的蓄積,實現(xiàn)靶向腫瘤遞送藥物的目的。在腫瘤組織弱酸性條件下,聚谷氨酸鏈段可發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,從而選擇性的暴露Tat肽,靶向腫瘤細(xì)胞發(fā)揮Tat肽的跨膜遞送作用,促進(jìn)藥物載體(藥物)吸收。聚谷氨酸的構(gòu)象轉(zhuǎn)變還可以在膠束外殼中形成通道,加速藥物釋放。 研究過程中,首先以L-谷氨酸-γ-芐酯N-羧基環(huán)內(nèi)酸酐為單體,端胺基聚乳酸為引發(fā)劑,經(jīng)陰離子開環(huán)聚合反應(yīng)和氫溴酸脫芐基保護(hù),制得兩種聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物,PGA5.6K-b-PLA1.8K和PGA12K-b-PLA6K。此外,通過巰基與馬來酰亞胺雙鍵間的Michael加成反應(yīng)將Tat肽鍵合在聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物的聚乙二醇端,反應(yīng)產(chǎn)率為91%。應(yīng)用核磁共振波譜、紅外光譜、凝膠滲透色譜和圓二色譜法分別對合成產(chǎn)物和中間體的化學(xué)結(jié)構(gòu),分子量(分子量單分散性)與構(gòu)象進(jìn)行表征。 分別應(yīng)用兩種聚谷氨酸—聚乳酸嵌段共聚物與Tat肽修飾的聚乙二醇—二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺嵌段共聚物(Tatp-PEG3.5K-b-DSPE),聚乙二醇—二硬脂�；字Ｒ掖及非抖喂簿畚�(PEG2K-b-DSPE)制備空白復(fù)合膠束,h-PMs-1(含PGA5.6K-b-PLA1.8K)和h-PMs-2(含PGA12K-b-PLA6K)。在pH6.5弱酸性環(huán)境中,h-PMs-1復(fù)合膠束可發(fā)生構(gòu)象變化(由PGA5.6K-b-PLA1.8K引發(fā)),使膠束粒徑減��；并暴露膠束外殼中的Tat肽,使膠束電位升高。h-PMs-2復(fù)合膠束的無構(gòu)象變化,無法充分暴露Tat肽,因此粒徑減小與電位升高的幅度均明顯小于h-PMs-2膠束。 應(yīng)用上述兩種空白復(fù)合膠束,采用透析法分別制備了阿霉素納米靶向復(fù)合膠束,D-h-1(含PGA5.6K-b-PLA1.8K)和D-h-2(含PGA12K-b-PLA6K)。兩種載藥復(fù)合膠束粒徑分別為95±1.72nm和165±1.55nm(pH7.4,強(qiáng)度徑),載藥量分別為9.82±1.01%和9.92±0.64%(質(zhì)量百分比)。體外釋放研究顯示,兩種復(fù)合膠束均呈現(xiàn)pH依賴性釋藥行為。隨著pH值的降低(pH7.4至5.5),聚谷氨酸鏈段發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,于復(fù)合膠束外殼中形成釋藥通道,加速藥物釋放。pH5.5介質(zhì)中,聚谷氨酸共聚物含量增加導(dǎo)致通道增多,進(jìn)一步加速阿霉素釋放。pH7.4的環(huán)境中,聚谷氨酸共聚物未發(fā)生構(gòu)象轉(zhuǎn)變,無法形成釋藥通道,因此藥物釋放速率并未隨著聚谷氨酸共聚物含量的增加而改變。 流式細(xì)胞術(shù)和激光共聚焦技術(shù)用于考查納米靶向復(fù)合膠束的細(xì)胞攝取行為。兩項研究共同證實pH7.4的條件下聚谷氨酸鏈段可抵抗酶解,保護(hù)Tat肽的活性。同時,這種保護(hù)作用還可屏蔽Tat肽的跨膜遞送作用。pH6.5時D-h-1復(fù)合膠束(含PGA5.6k-b-PLA,.8k)可通過構(gòu)象轉(zhuǎn)變暴露Tat肽,從而靶向腫瘤細(xì)胞外特有的弱酸性微環(huán)境發(fā)揮Tat肽的跨膜遞送功能,增加載藥膠束的吸收。同樣條件下,D-h-2復(fù)合膠束(含PGA1ZK-b-PLA6K)的構(gòu)象無變化,因此細(xì)胞對D-h-2復(fù)合膠束的攝取量顯著低于前者。 細(xì)胞藥效學(xué)考查顯示,增加細(xì)胞對載藥復(fù)合膠束的攝取將提高藥物的細(xì)胞毒作用、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡作用和抑制細(xì)胞遷移能力。D-h-1復(fù)合膠束可顯著性降低線粒體內(nèi)跨膜電位,進(jìn)而誘導(dǎo)A375細(xì)胞凋亡。該復(fù)合膠束在細(xì)胞劃痕實驗中也顯示了較強(qiáng)的抑制A375細(xì)胞移行的能力。D-h-2復(fù)合膠束的細(xì)胞毒性、誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡能力,以及抑制A375細(xì)胞移行的能力均明顯弱于D-h-1復(fù)合膠束。 最后,本文應(yīng)用A375人黑色素瘤細(xì)胞荷瘤裸鼠模型評價不同載藥復(fù)合膠束的體內(nèi)藥效學(xué)作用,并應(yīng)用近紅外成像技術(shù)考查不同載藥復(fù)合膠束的體內(nèi)分布。研究結(jié)果顯示,D-h-1復(fù)合膠束對A375黑色素瘤生長具有較強(qiáng)的抑制作用,荷瘤鼠生存期延長(接種73天后全部死亡),并有效維持荷瘤鼠體重。成像研究顯示,單次靜脈注射后,24小時內(nèi)可在腫瘤部位觀察到D-h-1復(fù)合膠束的強(qiáng)熒光信號,而其他各主要臟器無熒光信號。相反,D-h-2復(fù)合膠束對瘤塊的生長抑制作用較弱,生存期縮短(接種54天后全部死亡),體重降低。成像研究顯示,靜注24小時后腫瘤組織內(nèi)熒光基本消失,而肝臟中卻顯示膠束的熒光信號。
【關(guān)鍵詞】：聚合谷氨酸 構(gòu)象轉(zhuǎn)變 鹽酸阿霉素 Tat肽 A375人黑色素瘤細(xì)胞 惡性黑色素瘤
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2014
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 前言14-39
• 參考文獻(xiàn)31-39
• 第一章 高分子輔料合成與性質(zhì)表征39-64
• 第一節(jié) 高分子輔料合成與表征40-56
• 一、試劑與儀器40-41
• 二、實驗部分41-45
• 2.1 高分子輔料合成41-45
• 2.2 產(chǎn)物結(jié)構(gòu)表征與分子量測定45
• 三、實驗結(jié)果45-56
• 3.1 反應(yīng)原理45-46
• 3.2 合成產(chǎn)物的~1H NMR圖譜46-52
• 3.3 合成產(chǎn)物的FT-IR圖譜52-55
• 3.4 合成產(chǎn)物的分子量測定55-56
• 第二節(jié) 高分子輔料體外細(xì)胞毒性研究56-62
• 一、儀器與試劑56
• 二、實驗部分56-57
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)56
• 2.2 MTT溶液配制56
• 2.3 工作溶液配制56-57
• 2.4 高分子輔料體外細(xì)胞毒性檢測57
• 三、實驗結(jié)果57-61
• 3.1 PGA_(5.6K)-b-PLA_(1.8K)體外細(xì)胞毒性檢測57-58
• 3.2 PGA_(12K)-b-PLA_(6K)體外細(xì)胞毒性檢測58-59
• 3.3 Tatp-PEG_(3.5k)-b-DSPE體外細(xì)胞毒性檢測59-61
• 四、討論61-62
• 本章小結(jié)62-63
• 參考文獻(xiàn)63-64
• 第二章 納米靶向復(fù)合膠束的制備及性質(zhì)表征64-74
• 一、儀器與試劑64-65
• 二、實驗部分65-66
• 2.1 納米靶向復(fù)合膠束制備65-66
• 2.2 聚合物與納米靶向復(fù)合膠束的構(gòu)象研究66
• 2.3 納米靶向復(fù)合膠束性質(zhì)表征66
• 2.4 高分子輔料臨界膠束濃度測定66
• 三、實驗結(jié)果66-71
• 3.1 聚合物與納米靶向復(fù)合膠束的構(gòu)象研究66-69
• 3.2 納米靶向復(fù)合膠束的性質(zhì)表征69-70
• 3.3 高分子輔料的臨界膠束濃度測定70-71
• 四、討論71-72
• 本章小結(jié)72-73
• 參考文獻(xiàn)73-74
• 第三章 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束的制備及性質(zhì)表征74-90
• 一、試劑與儀器75
• 二、實驗部分75-79
• 2.1 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束制備75-76
• 2.2 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束性質(zhì)表征76
• 2.2.1 載藥復(fù)合膠束粒徑和電位測定76
• 2.2.2 透射電子顯微鏡觀察載藥膠束形態(tài)76
• 2.2.3 X射線衍射技術(shù)考查復(fù)合膠束中藥物的晶型76
• 2.3 載藥量與包封率測定76-78
• 2.3.1 鹽酸阿霉素分析方法建立76-77
• 2.3.2 載藥量與包封率測定77-78
• 2.4 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束體外釋藥行為研究78
• 2.4.1 介質(zhì)pH值對載藥復(fù)合膠束釋藥行為的影響78
• 2.4.2 PGA_(5.6K)-b-PLA_(1.8K)含量對載藥復(fù)合膠束體外釋藥行為的影響78
• 2.5 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束處方單因素考查78-79
• 2.5.1 阿霉素/高分子輔料質(zhì)量比78
• 2.5.2 PGA_(5.6K)-b-PLA_(1.8K)/PEG_(2K)-b-DSPE質(zhì)量比78
• 2.5.3 PGA_(5.6K)-PLA_(1.8K)/Tatp-PEG_(3.5K)-b-DSPE質(zhì)量比78-79
• 三、實驗結(jié)果79-86
• 3.1 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束性質(zhì)表征79-81
• 3.1.1 載藥復(fù)合膠束粒徑和電位值測定79-80
• 3.1.2 透射電子顯微鏡觀察載藥復(fù)合膠束的形態(tài)80
• 3.1.3 X射線衍射技術(shù)考查復(fù)合膠束中藥物的晶型80-81
• 3.2 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束載藥量與包封率測定81-82
• 3.3 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束體外釋藥行為研究82-84
• 3.3.1 介質(zhì)pH值對復(fù)合膠束釋藥行為的影響82
• 3.3.2 PGA_(5.6K)-b-PLA_(1.8K)含量對載藥復(fù)合膠束釋藥行為的影響82-83
• 3.3.3 載藥復(fù)合膠束釋藥機(jī)制83-84
• 3.4 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束處方單因素考察84-86
• 3.4.1 阿霉素/高分子輔料質(zhì)量比84-85
• 3.4.2 PGA_(5.6K)-b-PLA_(1.8K)/PEG_(2K)-b-DSPE質(zhì)量比85
• 3.4.3 PGA_(5.6K)-b-PLA_(1.8K)/Tatp-PEG_(3.5K)-b-DSPE質(zhì)量比85-86
• 四、討論86-87
• 本章小結(jié)87-88
• 參考文獻(xiàn)88-90
• 第四章 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束體外細(xì)胞攝取行為研究90-102
• 一、儀器與試劑91-92
• 二、實驗部分92-93
• 2.1 尼羅紅標(biāo)記納米靶向復(fù)合膠束的制備與性質(zhì)表征92
• 2.2 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束的制備與性質(zhì)表征92-93
• 2.3 激光共聚焦顯微鏡觀察尼羅紅標(biāo)記復(fù)合膠束的細(xì)胞攝取行為93
• 2.4 流式細(xì)胞儀檢測阿霉素復(fù)合膠束的細(xì)胞攝取93
• 三、實驗結(jié)果93-98
• 3.1 尼羅紅標(biāo)記納米靶向復(fù)合膠束的性質(zhì)表征94
• 3.2 流式細(xì)胞儀檢測復(fù)合膠束的細(xì)胞攝取94-97
• 3.3 激光共聚焦顯微鏡觀察復(fù)合膠束的細(xì)胞攝取97-98
• 四、討論98-100
• 本章小結(jié)100-101
• 參考文獻(xiàn)101-102
• 第五章 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束抗黑色素瘤細(xì)胞藥效學(xué)研究102-115
• 第一節(jié) 細(xì)胞毒作用評價103-106
• 一、試劑與儀器103-104
• 二、實驗部分104-105
• 2.1 A375細(xì)胞培養(yǎng)104
• 2.2 MTT溶液配制104
• 2.3 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束的制備104
• 2.4 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束抑制A375細(xì)胞增殖104-105
• 2.5 統(tǒng)計學(xué)分析105
• 三. 實驗結(jié)果105-106
• 第二節(jié) 誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡研究106-111
• 一、儀器及試劑106
• 二、實驗部分106-107
• 2.1 A375細(xì)胞培養(yǎng)與阿霉素納米靶向復(fù)合膠束的制備106-107
• 2.2 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡107
• 2.3 阿霉素復(fù)合膠束對A375細(xì)胞線粒體內(nèi)跨膜電位的影響107
• 三、實驗結(jié)果107-111
• 3.1 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡107-109
• 3.2 阿霉素復(fù)合膠束對A375細(xì)胞線粒體內(nèi)跨膜電位的影響109-111
• 第三節(jié) 抑制腫瘤細(xì)胞遷移研究111-113
• 一、儀器及試劑111
• 二、實驗部分111-112
• 2.1 A375細(xì)胞培養(yǎng)與阿霉素納米靶向復(fù)合膠束的制備111
• 2.2 A375細(xì)胞劃痕愈合實驗111-112
• 三、實驗結(jié)果112-113
• 四、討論113
• 本章小結(jié)113-114
• 參考文獻(xiàn)114-115
• 第六章 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束抗黑色素瘤體內(nèi)藥效學(xué)研究115-133
• 一、儀器、試劑與動物115-116
• 二、實驗方法116-119
• 2.1 中性甲醛溶液配制116-117
• 2.2 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束抗黑色素瘤體內(nèi)藥效學(xué)評價117-118
• 2.3 近紅外探針標(biāo)記的納米靶向復(fù)合膠束體內(nèi)分布研究118-119
• 三、實驗結(jié)果119-130
• 3.1 阿霉素納米靶向復(fù)合膠束抗黑色素瘤體內(nèi)藥效學(xué)評價119-126
• 3.2 近紅成像評價納米靶向復(fù)合膠束體內(nèi)分布126-130
• 四、討論130-131
• 本章小結(jié)131-132
• 參考文獻(xiàn)132-133
• 全文總結(jié)及展望133-137
• 綜述137-149
• 參考文獻(xiàn)145-149
• 作者簡介149-151
• 致謝151-152

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：810162