本文關(guān)鍵詞：磁珠分選半相合基因鼠效應(yīng)細(xì)胞免疫治療黑色素瘤的研究

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【摘要】：目的:本實(shí)驗(yàn)以黑色素瘤B16細(xì)胞接種于C57BL/6雌鼠背部,建立小鼠黑色素瘤模型。體外應(yīng)用C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1(BABL/C×C57BL/6的雜交子一代,雌性)脾臟來(lái)源的樹(shù)突狀細(xì)胞負(fù)載腫瘤全抗原與半相合效應(yīng)性淋巴細(xì)胞共培養(yǎng),隨后檢測(cè)效應(yīng)細(xì)胞體外殺傷黑色素瘤效應(yīng)。然后經(jīng)過(guò)磁珠分選純化后富集分泌IFN-γ的半相合效應(yīng)細(xì)胞,將其作用于荷瘤C57BL/6雌鼠體內(nèi),檢測(cè)純化后的半相合效應(yīng)細(xì)胞對(duì)腫瘤微環(huán)境中炎性因子IL-2及IFN-γ的影響,觀察各組小鼠腫瘤體積變化,生存期,GVHD程度,為腫瘤微環(huán)境干擾介導(dǎo)的細(xì)胞免疫治療技術(shù)在臨床的應(yīng)用提供新的理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。方法:1體外培養(yǎng)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞,建立C57BL/6小鼠黑色素瘤模型。2 C57BL/6鼠及半相合基因鼠CB6F1來(lái)源負(fù)載全腫瘤抗原DC的制備:取C57BL/6、CB6F1小鼠骨髓細(xì)胞,體外貼壁分選后加入rm GM-CSF、rm IL-4、黑色素瘤B16細(xì)胞凍融抗原,TNF-α誘導(dǎo)培養(yǎng)腫瘤抗原致敏的成熟DC(matured DC,m DC)。3磁珠分選效應(yīng)性T細(xì)胞的制備:將CB6F1小鼠脾細(xì)胞,經(jīng)淋巴分離液分離獲得淋巴細(xì)胞,尼龍毛柱吸附法收集T淋巴細(xì)胞。培養(yǎng)T淋巴細(xì)胞2天后,加入腫瘤抗原致敏的成熟DC,混合培養(yǎng)3-4天,即可獲得腫瘤抗原刺激后的活化效應(yīng)性T細(xì)胞。應(yīng)用磁珠陽(yáng)性分選方法富集上述活化半相合基因效應(yīng)T細(xì)胞中分泌IFN-γ的半相合效應(yīng)細(xì)胞。4 CCK-8法檢測(cè)三組效應(yīng)性T細(xì)胞體外殺傷實(shí)驗(yàn):將(A組)CB6F1來(lái)源DC和(B組)C57BL/6來(lái)源DC及(C組)二者混合的DC誘導(dǎo)產(chǎn)生的CTL(作為效應(yīng)細(xì)胞,E)分別與小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞(作為靶細(xì)胞,T)按E∶T=50∶1、20∶1和10∶1的比例混合后孵育24 h,加入CCK-8試劑(20μL/孔),酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔450 nm波長(zhǎng)的A值,并計(jì)算效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷率。5實(shí)驗(yàn)動(dòng)物分組及治療:將荷瘤小鼠C57BL/6完全隨機(jī)分至3組,每組40只。(A組)荷瘤對(duì)照組:每只荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml生理鹽水;(B組)環(huán)磷酰胺治療組:每只荷瘤小鼠腹腔注入(100mg/kg)環(huán)磷酰胺;(C組)磁珠分選純化半相合CTL治療組:每只荷瘤小鼠鼠尾靜脈注射0.2ml(1×106個(gè)/0.2ml)磁珠分選富集的IFN-γ陽(yáng)性CB6F1來(lái)源效應(yīng)性T細(xì)胞。觀察治療后各組荷瘤鼠腫瘤體積變化及生存期。6分別在細(xì)胞治療后的第1、4、7、10、14天取小鼠的血清,采用ELISA法檢測(cè)觀察治療后血清中IL-2、IFN-γ含量及其變化,并比較不同治療方法對(duì)荷瘤鼠外周血中兩細(xì)胞因子產(chǎn)生的影響。7磁珠分選純化效應(yīng)細(xì)胞治療后第14天,HE染色觀察各組小鼠瘤組織以及肝、脾和小腸組織的形態(tài)學(xué)變化。結(jié)果:1 C57BL/6小鼠經(jīng)皮下接種5×106 B16黑色素瘤細(xì)胞株7天后可見(jiàn)小鼠皮下明顯的黑色結(jié)節(jié),直徑達(dá)0.5cm。2小鼠骨髓來(lái)源DC細(xì)胞培養(yǎng)至第6天,倒置相差顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)大量具有典型毛刺狀形態(tài)的成熟DC細(xì)胞懸浮在上清液中聚集成團(tuán),提示DC已經(jīng)發(fā)育成熟,具備提呈抗原能力。3 CCK-8法檢測(cè)不同來(lái)源DC提呈腫瘤抗原激活產(chǎn)生的效應(yīng)性T細(xì)胞體外殺傷效率:效靶比為50:1及20:1條件下A組(CB6F1來(lái)源DC)誘導(dǎo)的效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞殺傷率優(yōu)于B組(C57BL/6來(lái)源DC)及C組(混合DC),且差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),B組及C組的殺傷率之間無(wú)顯著差別(P0.05);效靶比10:1條件下A、B、C三組效應(yīng)T細(xì)胞對(duì)B16細(xì)胞殺傷率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4各組荷瘤小鼠腫瘤體積變化:單純注射PBS的對(duì)照組和環(huán)磷酰胺組小鼠腫瘤生長(zhǎng)迅速,給予磁珠分選純化的半相合基因型DC-CTL過(guò)繼治療后,小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度從第7天至第20天較對(duì)照組顯著下降。5各組小鼠生存期:A組(荷瘤對(duì)照組),B組(環(huán)磷化療組),C組(細(xì)胞治療組)間生存期比較,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。6 ELISA法檢測(cè)治療后不同時(shí)間小鼠外周血中IL-2和IFN-γ的濃度:在磁珠分選效應(yīng)細(xì)胞治療組中血清IL-2及IFN-γ的含量明顯高于荷瘤對(duì)照組(P0.05)。荷瘤小鼠給予磁珠分選效應(yīng)細(xì)胞治療后,血清IL-2和IFN-γ含量伴隨著時(shí)間的變化,出現(xiàn)逐漸升高的趨勢(shì),三組外周血中IL-2的濃度均存在顯著性差異(P0.05)。7 HE染色結(jié)果:各組荷瘤小鼠瘤組織內(nèi)壞死面積,磁珠分選細(xì)胞治療組和環(huán)磷化療組明顯大于對(duì)照組;觀察磁珠分選細(xì)胞治療后小鼠肝、小腸、脾臟組織中未見(jiàn)明顯組織損傷形態(tài)學(xué)變化。結(jié)論:1在體外實(shí)驗(yàn)中,分別來(lái)源于CB6F1及C57BL/6的DC及兩種混合DC誘導(dǎo)的半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞對(duì)小鼠黑色素瘤B16細(xì)胞均能產(chǎn)生殺傷效應(yīng),且CB6F1來(lái)源的DC誘導(dǎo)的半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞的殺傷率明顯高于其他兩種誘導(dǎo)方式,另外兩種誘導(dǎo)方式之間的殺傷率未見(jiàn)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。2與環(huán)磷化療組及荷瘤對(duì)照組比較,磁珠分選半相合基因型效應(yīng)細(xì)胞治療組7至21天小鼠腫瘤生長(zhǎng)速度顯著下降。說(shuō)明磁珠分選的效應(yīng)細(xì)胞對(duì)小鼠腫瘤生長(zhǎng)具有明顯抑制作用,然而,環(huán)磷化療組與荷瘤對(duì)照組相比,其腫瘤生長(zhǎng)抑制作用無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。3磁珠分選半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療與環(huán)磷酰胺化療都能夠有效延長(zhǎng)荷瘤C57BL/6小鼠的生存期,但磁珠分選細(xì)胞治療組的生存期明顯優(yōu)于環(huán)磷化療組。4磁珠分選半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞過(guò)繼免疫治療后,可以明顯提高外周血IL-2、IFN-γ的濃度,對(duì)IL-2濃度的影響優(yōu)于環(huán)磷酰胺化療組,對(duì)IFN-γ濃度的影響與環(huán)磷酰胺化療組無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差別。5輸注CB6F1來(lái)源的磁珠分選半相合基因效應(yīng)性T細(xì)胞的荷瘤C57BL/6小鼠未出現(xiàn)GVHD反應(yīng)。
【關(guān)鍵詞】：過(guò)繼細(xì)胞免疫治療 半相合基因 磁珠分選 環(huán)磷酰胺 惡性黑色素瘤 移植物抗宿主反應(yīng)
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-14
• 材料與方法14-22
• 結(jié)果22-25
• 附圖25-31
• 附表31-33
• 討論33-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻(xiàn)38-41
• 綜述 過(guò)繼輸注半相合基因免疫細(xì)胞在實(shí)體腫瘤治療中的應(yīng)用41-50
• 參考文獻(xiàn)47-50
• 致謝50-51
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷51

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 艾輝勝;非清髓異基因造血干細(xì)胞移植——造血干細(xì)胞移植的新方向[J];解放軍醫(yī)學(xué)雜志;2001年01期

2 任歡,邢淑賢,徐紅薇,宋英暉,商曉舟,周貴生,田景先,李殿俊;CIK的體外增殖及體內(nèi)外殺瘤活性的實(shí)驗(yàn)研究[J];中國(guó)腫瘤生物治療雜志;1999年01期

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本文編號(hào)：810408