本文關鍵詞：毛囊源性黑色素細胞的分離、培養(yǎng)、鑒定

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【摘要】：研究背景:黑色素細胞Melanocytes(MC),是脊椎動物皮膚、毛發(fā)著色的主要細胞,主要存在于表皮基底層,還有少量存在于毛囊;其功能缺失或者減弱,會導致白發(fā)、白癜風等一系列難治性脫色素性疾病發(fā)生。哺乳動物毛囊Hair follicle(HF)是表皮向真皮凹陷后形成的皮膚附屬結構,其能控制毛發(fā)生長以及著色,且呈周期性變化,經歷著生長期、退行期和休止期三個時期,其自我更新能力也比較強;其在維持內環(huán)境穩(wěn)定、參與修復皮膚創(chuàng)傷、維持皮膚以及毛發(fā)的著色等過程中有著重要功能。作為一種容易獲得的組織,其內有多種細胞可以用于再生醫(yī)學,而其內的黑色素細胞就是一種與皮膚、毛發(fā)著色息息相關的細胞。在毛囊中,黑色素干細胞形成一種干細胞系統(tǒng),能夠逐步成熟并分化成HF-MCs,可以既可以向上遷移、分化形成表皮黑色素細胞,表皮中MC與周圍的角朊細胞一起為每個周期循環(huán)中的皮膚著色提供“黑色素單位”;又可以向下遷移、分化形成定位于毛乳頭上方的黑色素細胞,有活性的毛囊源性黑色素細胞既可以為毛發(fā)又可以為皮膚提供黑色素使其著色,隨著毛囊的周期性循環(huán),毛囊內的黑色素細胞(HF-MCs)也呈周期性的合成黑色素。相比于表皮中的黑色素細胞,體外培養(yǎng)毛囊源性MC不僅具有來源上的優(yōu)勢,而且在功能上也比表皮黑色素細胞更全面,能夠從根本上解釋色素的減退,一定程度上為色素障礙性疾病的治療開辟了新的途徑。再者,毛發(fā)顏色的減退并不能用表皮來源MC的理論解釋,這就促使學者們更熱衷于HF-MCs的研究。研究目的:建立皮膚毛囊源性黑色素細胞的分離、培養(yǎng)、純化和擴增技術,為毛囊源性黑色素細胞生物學研究提供前期實驗基礎。研究方法:1、毛囊源性黑色素細胞定位取出生后11天處于生長期C57小鼠的皮膚,10%甲醛固定后,梯度酒精脫水,石蠟包埋。切成5μm厚,進行常規(guī)HE染色、甲苯胺藍染色、免疫熒光染色、免疫組織化學染色。2、毛囊源性黑色素細胞分離、培養(yǎng)、純化和鑒定取生長期C57乳鼠的背部皮膚全層組織,修剪成0.2cm*0.2cm大小;用Dispase II 4℃消化過夜后去除表皮。然后用0.1%I型膠原酶37℃下消化真皮組織1-2小時,反復吹打使毛囊從真皮中游離出來。1500rpm離心5分鐘,獲得毛囊,再用0.25%胰酶37℃下消化毛囊1-5分鐘,獲得毛囊來源干細胞(Hair follicle-derived stem cells,HF-SCs)。將HF-SCs用含有HMGS的MCs選擇培養(yǎng)基M-254培養(yǎng)。采用RT-PCR、L-DOPA染色、免疫熒光染色和Western Blot以及流式細胞技術從m RNA水平、蛋白水平和形態(tài)上檢測MCs特異基因、蛋白的表達。研究結果:HE染色,免疫熒光,免疫組織化學分析結果顯示處于生長期的毛囊中存在黑色素細胞,成熟HF-MCs主要存在于真皮乳頭上方,還有部分未活化的存在于外毛根鞘,而黑色素干細胞多存在于隆突部位;L-DOPA染色結果顯示毛囊來源細胞培養(yǎng)至P3時,染色呈棕黑色陽性反應,細胞多呈兩極狀或者多角狀,L-DOPA反應陽性;RT-PCR分析結果顯示HF-MCs含有黑色素細胞的標志基因:MITF、TYR、TRP1等;免疫熒光、流式細胞術以及Western blot分析結果顯示獲得的細胞表達MITF、TYR、TRP1蛋白。結果證實,在選擇培養(yǎng)基條件下培養(yǎng)的細胞具有黑色素細胞的形態(tài),表達黑色素細胞的標志物,能夠合成黑色素顆粒。結論:1、成功在體外分離、培養(yǎng)出毛囊源性黑色素細胞。2、經體外一系列鑒定實驗表明,所培養(yǎng)的黑色素細胞表達MITF、TYR、TRP1等標志蛋白,成功培養(yǎng)出毛囊源性黑色素細胞。
【關鍵詞】：皮膚 毛囊 黑色素細胞 鑒定
【學位授予單位】：吉林大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R751
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 英文縮寫詞表11-12
• 第一章 緒論12-26
• 1.1 毛囊13-15
• 1.1.1 毛囊的結構13-14
• 1.1.2 毛囊的周期14
• 1.1.3 毛囊的組成細胞14-15
• 1.2 黑色素細胞的生物學特性15-21
• 1.2.1 黑色素細胞的起源以及其胚胎發(fā)育過程中的轉錄調節(jié)因子15-16
• 1.2.2 黑色素細胞的形態(tài)和主要功能16-17
• 1.2.3 黑色素細胞參與毛囊周期性循環(huán)17-18
• 1.2.4 黑色素干細胞的遷移途徑18-19
• 1.2.5 毛囊黑色素細胞的存在部位以及各部位的特性19
• 1.2.6 黑色素顆粒的合成以及轉運19-20
• 1.2.7 黑色素細胞標志物20-21
• 1.3 毛囊源性黑色素細胞體外分離方法21-22
• 1.4 毛囊源性黑色素細胞體外培養(yǎng)方法22-23
• 1.5 毛囊源性黑色素細胞體外鑒定方法23-24
• 1.6 總結與展望24-26
• 第二章 研究內容26-50
• 2.1 黑色素細胞的分離獲取26-34
• 2.1.1 實驗材料26-27
• 2.1.2 實驗方法27-30
• 2.1.3 實驗結果30-34
• 2.2 黑色素細胞的鑒定34-45
• 2.2.1 實驗材料34-36
• 2.2.2 實驗方法36-41
• 2.2.3 實驗結果41-45
• 2.3 含Luciferase-GFP的質粒進行病毒包裝并轉導入黑色素細胞45-50
• 2.3.1 實驗材料45-46
• 2.3.2 實驗方法46-48
• 2.3.3 實驗結果48-50
• 第三章 討論50-53
• 第四章 結論53-54
• 參考文獻54-61
• 作者簡介61-62
• 在校期間所獲科研成果以及相關研究62-63
• 致謝63

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前10條

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