本文關(guān)鍵詞：加味四君子湯治療惡性黑色素細(xì)胞瘤作用及機(jī)制的研究

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【摘要】：目的：惡性黑色素瘤（Malignant melanoma, MM）是由黑色素細(xì)胞惡性轉(zhuǎn)化形成，具有高侵襲和高轉(zhuǎn)移特性的惡性腫瘤。MM因其持續(xù)增長(zhǎng)的發(fā)病率和死亡率日益受到人們的重視，其發(fā)病率年平均增長(zhǎng)速度為4%～6%，在近二十年中成倍增長(zhǎng)。到目前為止，對(duì)MM的治療主要包括手術(shù)、生物治療、放療、化療和腫瘤疫苗，然而，只要MM發(fā)生轉(zhuǎn)移，幾乎沒有任何治療方法可以治愈。唯一由美國(guó)食品和藥品管理局批準(zhǔn)的治療轉(zhuǎn)移性黑色素瘤的藥物達(dá)卡巴嗦，其完全緩解率尚未超過5%。這可能是由多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)引起，引起多藥耐藥最主要的機(jī)制是腫瘤細(xì)胞凋亡通路障礙。因此，如何解決化療藥物的多藥耐藥性，進(jìn)而提高黑色素瘤腫瘤細(xì)胞凋亡是現(xiàn)代醫(yī)學(xué)丞待解決的問題。 中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，中藥在抗腫瘤作用中占有重要地位，尤其在抗耐藥性和減毒增效方面更具有顯著優(yōu)勢(shì)。隨著相關(guān)研究的深入，業(yè)內(nèi)學(xué)者認(rèn)同“肺主皮毛”理論不能簡(jiǎn)單的理解為肺主管體表皮膚、粘膜、汗腺、發(fā)須等生理功能上的皮毛，而是對(duì)抗病邪時(shí)與“肌表”相似，是呼吸道和皮膚免疫功能相互影響相互協(xié)調(diào)的免疫反饋機(jī)制，大量臨床觀察表明肺與皮毛在發(fā)病機(jī)制和免疫機(jī)制上可能有相似之處，有人觀察到濕疹性皮炎患者發(fā)病前后均患有肺部疾患；支氣管哮喘患者64%患有皮膚疾病，臨床同一藥物既可治療肺系病變，也可治療皮膚疾患。有學(xué)者總結(jié)治療肺癌最常用的中藥有26味，本研究中有7味中藥構(gòu)成組方，其中白術(shù)、茯苓、甘草、浙貝母和莪術(shù)5味中藥屬于此26味中藥之中，且肺癌治療多采用以扶正為主的補(bǔ)氣方劑，以四君子湯為基礎(chǔ)加減使用頻次最多，已有學(xué)者證明四君子湯加減對(duì)肺癌治療療效確切。培土生金也稱補(bǔ)脾益肺，是治療肺脾兩虛證的一種治法。按五行相生規(guī)律肺金與脾土為子母關(guān)系，按虛則補(bǔ)其母的治則，運(yùn)用培土生金之法，健脾胃可以益肺氣，待脾氣充實(shí)，健運(yùn)復(fù)職，土旺則金自生，肺虛之候自去。脾肺同屬太陰，主行于人身胸腹，兩經(jīng)密切相連，經(jīng)氣相通，氣血相貫�，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究表明，人類腫瘤特異性免疫治療的重要物質(zhì)基礎(chǔ)是腫瘤抗原的存在，肺癌和黑色素瘤表達(dá)共同的黑色素瘤抗原(melanoma antigen, MAGE)MAGE-1和MAGE-3，提示這兩種疾病可能有相似的抗腫瘤免疫應(yīng)答機(jī)制。綜上，從中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學(xué)兩個(gè)層面支撐，精選四君子湯作為基礎(chǔ)方劑，酌加治療肺癌有效的藥物，可能對(duì)治療皮膚腫瘤有效。且現(xiàn)代藥理學(xué)證明，貝母苷甲抑制人高轉(zhuǎn)移巨細(xì)胞肺癌細(xì)胞的粘附、侵襲和遷移能力，同樣土貝母苷甲對(duì)小鼠B16黑色素瘤和Lewis肺癌轉(zhuǎn)移均具有抑制作用。莪術(shù)揮發(fā)油對(duì)多種癌細(xì)胞既有直接破壞作用，又能通過增強(qiáng)免疫系統(tǒng)功能發(fā)揮抗癌作用，莪術(shù)醇通過非依賴Caspase途徑來介導(dǎo)肺癌A549細(xì)胞的凋亡，同樣發(fā)現(xiàn)莪術(shù)水提波能夠抑制黑色素瘤高轉(zhuǎn)移細(xì)胞株B16的轉(zhuǎn)移，可能與其能夠抑制B16與細(xì)胞外基質(zhì)的粘附以及降低B16的侵襲性和運(yùn)動(dòng)能力有關(guān)。半枝蓮有增加機(jī)體免疫功能和抗腫瘤作用，對(duì)人肺巨細(xì)胞癌細(xì)胞株P(guān)G細(xì)胞端粒酶活性的影響明顯下降，其提取物抗肺癌A549細(xì)胞生長(zhǎng)。因而，本研究在四君子湯基礎(chǔ)上，酌選浙貝母、莪術(shù)和半枝蓮組成加味四君子湯治療MM。 Bcl-2和Caspase是公認(rèn)的凋亡相關(guān)基因，Bcl-2家族是凋亡抑制基因，對(duì)凋亡有抑制作用，研究表明，抑制Bcl-2蛋白的表達(dá)可以促進(jìn)MM細(xì)胞凋亡。凋亡相關(guān)蛋白Caspases被激活后能促進(jìn)凋亡，其中Caspase3和Caspase9的激活尤為重要，引起細(xì)胞凋亡。 基質(zhì)金屬蛋白酶(metalloprotease, MMP)是一個(gè)能夠水解某些蛋白成分的蛋白家族，因其需要Ca~(2+)、Zn~(2+)等金屬離子作為輔助因子而得名，其家族成員具有相似的結(jié)構(gòu)，其中MMP2、MMP9研究的較為深入，MMPs幾乎能降解細(xì)胞外基質(zhì)（extracellular matrix，ECM）中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細(xì)胞遷移侵襲的組織學(xué)屏障，在腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移中起關(guān)鍵性作用，從而在腫瘤遷移浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移中的作用日益受到重視，MMP被認(rèn)為腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移過程中主要的蛋白水解酶。 轉(zhuǎn)錄因子核因子NF-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)是由五種不同蛋白(p50, p52,p65/RelA, RelB, c-Rel)組成的二聚體。通常NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB相結(jié)合，以無活性的形式存在于細(xì)胞漿中，當(dāng)多種刺激激活I(lǐng)κB激酶誘導(dǎo)IκB蛋白水解后，，NF-κB的DNA結(jié)合結(jié)構(gòu)域和核定位序列暴露出來，使NF-κB轉(zhuǎn)位到細(xì)胞核，誘導(dǎo)靶基因轉(zhuǎn)錄。有大量文獻(xiàn)已明確NF-κB (p65)是Bcl-2、MMP2和MMP9正性轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，而Bcl-2的低表達(dá)可以通過誘導(dǎo)線粒體途徑和受體途徑使Caspase3和Caspase9表達(dá)升高。 本研究首先建立體外B16MM模型，利用血清藥理學(xué)方法給藥，利用MTT法確認(rèn)加味四君子湯的最佳作用時(shí)間和最佳作用劑量；其次研究加味四君子湯對(duì)B16MM細(xì)胞凋亡的影響，以及調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2、Caspase3和Caspase9表達(dá)；再次研究加味四君子湯對(duì)B16MM細(xì)胞遷移侵襲的影響，以及相關(guān)蛋白MMP2和MMP9的表達(dá)；最后研究可能參與調(diào)節(jié)上述蛋白表達(dá)的信號(hào)分子NF-κB的活性和蛋白表達(dá)，進(jìn)一步明確加味四君子湯抗惡性黑色素瘤的機(jī)制。 材料與方法： 1.體外MM模型的制備。 2.血清藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)方法給藥。 3.細(xì)胞增殖抑制試驗(yàn)即MTT法檢測(cè)加味四君子湯含藥血清對(duì)B16MM細(xì)胞增殖的影響。 4.應(yīng)用流式細(xì)胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測(cè)加味四君子湯含藥血清對(duì)B16MM細(xì)胞凋亡的影響。 5.應(yīng)用細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)和Transwell實(shí)驗(yàn)檢測(cè)加味四君子湯含藥血清對(duì)B16MM細(xì)胞遷移和侵襲的影響。 6.應(yīng)用半定量RT-PCR法檢測(cè)遷移和侵襲相關(guān)基因MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)；檢測(cè)抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA表達(dá)，檢測(cè)促進(jìn)凋亡基因Caspase3和Caspase9的mRNA表達(dá)。 7.應(yīng)用Western blot法檢測(cè)遷移和侵襲相關(guān)基因MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)；檢測(cè)抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表達(dá)，檢測(cè)促進(jìn)凋亡基因Caspase3和Caspase9的蛋白表達(dá)；檢測(cè)轉(zhuǎn)錄因子核因子NF-κB (p65)的蛋白表達(dá)。 8.不同劑量的加味四君子湯含藥血清作用于B16細(xì)胞24h后，應(yīng)用Trans AMTMNF-κB (p65)活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)其活性。 結(jié)果： 1.成功建立了體外MM模型。 2.成功制備加味四君子湯含藥血清。 3.加味四君子湯含藥血清作用后，抑制B16MM細(xì)胞增殖，作用12，24，48h，與同時(shí)間段空白對(duì)照組和血清對(duì)照組相比，以劑量依賴方式抑制B16惡性黑色素細(xì)胞增殖，中劑量加味四君子湯含藥血清組24，48h抑制率為50.22%，53.81%，且48h與24h相比沒有顯著性變化。 4.加味四君子湯含藥血清作用后，不同劑量的加味四君子湯含藥血清作用于B16細(xì)胞24h后，應(yīng)用Annexin V-FITC/PI雙標(biāo)記法檢測(cè)細(xì)胞凋亡，結(jié)果表明加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式促進(jìn)B16MM細(xì)胞凋亡，各組凋亡率分別為：空白對(duì)照組(2.97±0.62)%，血清對(duì)照組(3.12±0.71)%，低劑量加味四君子湯含藥血清組(7.10±0.95)%，中劑量中藥組(19.70±0.98)%，高劑量中藥組(25.21±1.03)%，順鉑組(21.31±1.00)%，除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 5.加味四君子湯含藥血清作用后，細(xì)胞劃痕試驗(yàn)觀察隨著加味四君子湯含藥血清劑量升高，B16細(xì)胞的遷移能力逐漸降低。但順鉑組遷移能力低于中劑量中藥組，高于高劑量中藥組。加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制B16細(xì)胞侵襲能力，各組穿過8μm含BD基質(zhì)膠的Transwell小室的細(xì)胞個(gè)數(shù)分別是78.5±3.3個(gè)，80.3±3.5個(gè)，70.6±3.0個(gè)，44.6±1.8個(gè)，38.8±1.2個(gè)，41.5±1.5個(gè),除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 6.不同劑量的加味四君子湯含藥血清作用于B16細(xì)胞24h后，應(yīng)用半定量RT-PCR法方法檢測(cè)Bcl-2、Caspase3、Caspase9、MMP2、MMP9mRNA的表達(dá)。結(jié)果表明，加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制Bcl-2mRNA表達(dá)，增加Caspase3和Caspase9mRNA表達(dá)，加味四君子湯含藥血清作用后，B16MM細(xì)胞侵襲相關(guān)基因MMP2和MMP9的mRNA表達(dá)降低，且以劑量依賴方式抑制MMP2和MMP9mRNA表達(dá)；除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 7.應(yīng)用Western Blot方法檢測(cè)，加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制Bcl-2蛋白表達(dá)，增加Caspase3和Caspase9蛋白表達(dá)，除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01），加味四君子湯含藥血清作用后，B16MM細(xì)胞侵襲相關(guān)基因MMP2和MMP9的蛋白表達(dá)降低，除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 8.加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制NF-κB(p65)蛋白表達(dá)，除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）；加味四君子湯含藥血清作用后，NF-κB (p65)活性降低，除空白對(duì)照組與血清對(duì)照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P0.01）。 結(jié)論： 1.加味四君子湯對(duì)治療肺癌有效的藥物對(duì)B16MM細(xì)胞有作用。 2.加味四君子湯含藥血清是通過下調(diào)凋亡抑制基因Bcl-2的表達(dá)，上調(diào)凋亡促進(jìn)基因Caspase3和Caspase9表達(dá)來實(shí)現(xiàn)促進(jìn)B16MM細(xì)胞凋亡，抑制B16MM細(xì)胞增殖。 3.加味四君子湯含藥血清是通過下調(diào)MMP2和MMP9表達(dá)來實(shí)現(xiàn)抑制B16MM細(xì)胞遷移和侵襲。 4. NF-κB(p65)是介導(dǎo)加味四君子湯含藥血清抑制B16惡性黑色素瘤的細(xì)胞遷移侵襲和促進(jìn)凋亡的信號(hào)分子。
【關(guān)鍵詞】：加味四君子湯 惡性黑色素瘤 凋亡 侵襲 NF-κB(p65)
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號(hào)】：R273;R739.5
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-15
• 文獻(xiàn)綜述15-27
• 參考文獻(xiàn)23-27
• 前言27-28
• 實(shí)驗(yàn)一28-41
• 1 實(shí)驗(yàn)材料28-30
• 2 實(shí)驗(yàn)方法30-35
• 3 統(tǒng)計(jì)分析35
• 4 結(jié)果35-41
• 實(shí)驗(yàn)二41-49
• 1 實(shí)驗(yàn)材料41-42
• 2 實(shí)驗(yàn)方法42-44
• 3 統(tǒng)計(jì)分析44
• 4 結(jié)果44-49
• 實(shí)驗(yàn)三49-53
• 1 實(shí)驗(yàn)材料49-50
• 2 實(shí)驗(yàn)方法50
• 3 統(tǒng)計(jì)分析50
• 4 結(jié)果50-53
• 分析討論53-67
• 結(jié)論67-68
• 參考文獻(xiàn)68-75
• 致謝75-76
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷76

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：772300