本文關鍵詞：加味四君子湯治療惡性黑色素細胞瘤作用及機制的研究

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【摘要】：目的：惡性黑色素瘤（Malignant melanoma, MM）是由黑色素細胞惡性轉化形成，具有高侵襲和高轉移特性的惡性腫瘤。MM因其持續(xù)增長的發(fā)病率和死亡率日益受到人們的重視，其發(fā)病率年平均增長速度為4%～6%，在近二十年中成倍增長。到目前為止，對MM的治療主要包括手術、生物治療、放療、化療和腫瘤疫苗，然而，只要MM發(fā)生轉移，幾乎沒有任何治療方法可以治愈。唯一由美國食品和藥品管理局批準的治療轉移性黑色素瘤的藥物達卡巴嗦，其完全緩解率尚未超過5%。這可能是由多藥耐藥(multidrug resistance，MDR)引起，引起多藥耐藥最主要的機制是腫瘤細胞凋亡通路障礙。因此，如何解決化療藥物的多藥耐藥性，進而提高黑色素瘤腫瘤細胞凋亡是現(xiàn)代醫(yī)學丞待解決的問題。 中醫(yī)學認為，中藥在抗腫瘤作用中占有重要地位，尤其在抗耐藥性和減毒增效方面更具有顯著優(yōu)勢。隨著相關研究的深入，業(yè)內(nèi)學者認同“肺主皮毛”理論不能簡單的理解為肺主管體表皮膚、粘膜、汗腺、發(fā)須等生理功能上的皮毛，而是對抗病邪時與“肌表”相似，是呼吸道和皮膚免疫功能相互影響相互協(xié)調的免疫反饋機制，大量臨床觀察表明肺與皮毛在發(fā)病機制和免疫機制上可能有相似之處，有人觀察到濕疹性皮炎患者發(fā)病前后均患有肺部疾患；支氣管哮喘患者64%患有皮膚疾病，臨床同一藥物既可治療肺系病變，也可治療皮膚疾患。有學者總結治療肺癌最常用的中藥有26味，本研究中有7味中藥構成組方，其中白術、茯苓、甘草、浙貝母和莪術5味中藥屬于此26味中藥之中，且肺癌治療多采用以扶正為主的補氣方劑，以四君子湯為基礎加減使用頻次最多，已有學者證明四君子湯加減對肺癌治療療效確切。培土生金也稱補脾益肺，是治療肺脾兩虛證的一種治法。按五行相生規(guī)律肺金與脾土為子母關系，按虛則補其母的治則，運用培土生金之法，健脾胃可以益肺氣，待脾氣充實，健運復職，土旺則金自生，肺虛之候自去。脾肺同屬太陰，主行于人身胸腹，兩經(jīng)密切相連，經(jīng)氣相通，氣血相貫。現(xiàn)代醫(yī)學研究表明，人類腫瘤特異性免疫治療的重要物質基礎是腫瘤抗原的存在，肺癌和黑色素瘤表達共同的黑色素瘤抗原(melanoma antigen, MAGE)MAGE-1和MAGE-3，提示這兩種疾病可能有相似的抗腫瘤免疫應答機制。綜上，從中醫(yī)理論和現(xiàn)代醫(yī)學兩個層面支撐，精選四君子湯作為基礎方劑，酌加治療肺癌有效的藥物，可能對治療皮膚腫瘤有效。且現(xiàn)代藥理學證明，貝母苷甲抑制人高轉移巨細胞肺癌細胞的粘附、侵襲和遷移能力，同樣土貝母苷甲對小鼠B16黑色素瘤和Lewis肺癌轉移均具有抑制作用。莪術揮發(fā)油對多種癌細胞既有直接破壞作用，又能通過增強免疫系統(tǒng)功能發(fā)揮抗癌作用，莪術醇通過非依賴Caspase途徑來介導肺癌A549細胞的凋亡，同樣發(fā)現(xiàn)莪術水提波能夠抑制黑色素瘤高轉移細胞株B16的轉移，可能與其能夠抑制B16與細胞外基質的粘附以及降低B16的侵襲性和運動能力有關。半枝蓮有增加機體免疫功能和抗腫瘤作用，對人肺巨細胞癌細胞株PG細胞端粒酶活性的影響明顯下降，其提取物抗肺癌A549細胞生長。因而，本研究在四君子湯基礎上，酌選浙貝母、莪術和半枝蓮組成加味四君子湯治療MM。 Bcl-2和Caspase是公認的凋亡相關基因，Bcl-2家族是凋亡抑制基因，對凋亡有抑制作用，研究表明，抑制Bcl-2蛋白的表達可以促進MM細胞凋亡。凋亡相關蛋白Caspases被激活后能促進凋亡，其中Caspase3和Caspase9的激活尤為重要，引起細胞凋亡。 基質金屬蛋白酶(metalloprotease, MMP)是一個能夠水解某些蛋白成分的蛋白家族，因其需要Ca~(2+)、Zn~(2+)等金屬離子作為輔助因子而得名，其家族成員具有相似的結構，其中MMP2、MMP9研究的較為深入，MMPs幾乎能降解細胞外基質（extracellular matrix，ECM）中的各種蛋白成分，破壞腫瘤細胞遷移侵襲的組織學屏障，在腫瘤侵襲轉移中起關鍵性作用，從而在腫瘤遷移浸潤轉移中的作用日益受到重視，MMP被認為腫瘤侵襲轉移過程中主要的蛋白水解酶。 轉錄因子核因子NF-κB (nuclear factor-kappa B, NF-κB)是由五種不同蛋白(p50, p52,p65/RelA, RelB, c-Rel)組成的二聚體。通常NF-κB二聚體與抑制蛋白IκB相結合，以無活性的形式存在于細胞漿中，當多種刺激激活IκB激酶誘導IκB蛋白水解后，，NF-κB的DNA結合結構域和核定位序列暴露出來，使NF-κB轉位到細胞核，誘導靶基因轉錄。有大量文獻已明確NF-κB (p65)是Bcl-2、MMP2和MMP9正性轉錄調控因子，而Bcl-2的低表達可以通過誘導線粒體途徑和受體途徑使Caspase3和Caspase9表達升高。 本研究首先建立體外B16MM模型，利用血清藥理學方法給藥，利用MTT法確認加味四君子湯的最佳作用時間和最佳作用劑量；其次研究加味四君子湯對B16MM細胞凋亡的影響，以及調節(jié)凋亡相關基因Bcl-2、Caspase3和Caspase9表達；再次研究加味四君子湯對B16MM細胞遷移侵襲的影響，以及相關蛋白MMP2和MMP9的表達；最后研究可能參與調節(jié)上述蛋白表達的信號分子NF-κB的活性和蛋白表達，進一步明確加味四君子湯抗惡性黑色素瘤的機制。 材料與方法： 1.體外MM模型的制備。 2.血清藥理學實驗方法給藥。 3.細胞增殖抑制試驗即MTT法檢測加味四君子湯含藥血清對B16MM細胞增殖的影響。 4.應用流式細胞儀Annexin V-FITC/PI法檢測加味四君子湯含藥血清對B16MM細胞凋亡的影響。 5.應用細胞劃痕實驗和Transwell實驗檢測加味四君子湯含藥血清對B16MM細胞遷移和侵襲的影響。 6.應用半定量RT-PCR法檢測遷移和侵襲相關基因MMP2和MMP9的mRNA表達；檢測抑制凋亡基因Bcl-2的mRNA表達，檢測促進凋亡基因Caspase3和Caspase9的mRNA表達。 7.應用Western blot法檢測遷移和侵襲相關基因MMP2和MMP9的蛋白表達；檢測抑制凋亡基因Bcl-2的蛋白表達，檢測促進凋亡基因Caspase3和Caspase9的蛋白表達；檢測轉錄因子核因子NF-κB (p65)的蛋白表達。 8.不同劑量的加味四君子湯含藥血清作用于B16細胞24h后，應用Trans AMTMNF-κB (p65)活性檢測試劑盒檢測其活性。 結果： 1.成功建立了體外MM模型。 2.成功制備加味四君子湯含藥血清。 3.加味四君子湯含藥血清作用后，抑制B16MM細胞增殖，作用12，24，48h，與同時間段空白對照組和血清對照組相比，以劑量依賴方式抑制B16惡性黑色素細胞增殖，中劑量加味四君子湯含藥血清組24，48h抑制率為50.22%，53.81%，且48h與24h相比沒有顯著性變化。 4.加味四君子湯含藥血清作用后，不同劑量的加味四君子湯含藥血清作用于B16細胞24h后，應用Annexin V-FITC/PI雙標記法檢測細胞凋亡，結果表明加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式促進B16MM細胞凋亡，各組凋亡率分別為：空白對照組(2.97±0.62)%，血清對照組(3.12±0.71)%，低劑量加味四君子湯含藥血清組(7.10±0.95)%，中劑量中藥組(19.70±0.98)%，高劑量中藥組(25.21±1.03)%，順鉑組(21.31±1.00)%，除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 5.加味四君子湯含藥血清作用后，細胞劃痕試驗觀察隨著加味四君子湯含藥血清劑量升高，B16細胞的遷移能力逐漸降低。但順鉑組遷移能力低于中劑量中藥組，高于高劑量中藥組。加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制B16細胞侵襲能力，各組穿過8μm含BD基質膠的Transwell小室的細胞個數(shù)分別是78.5±3.3個，80.3±3.5個，70.6±3.0個，44.6±1.8個，38.8±1.2個，41.5±1.5個,除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 6.不同劑量的加味四君子湯含藥血清作用于B16細胞24h后，應用半定量RT-PCR法方法檢測Bcl-2、Caspase3、Caspase9、MMP2、MMP9mRNA的表達。結果表明，加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制Bcl-2mRNA表達，增加Caspase3和Caspase9mRNA表達，加味四君子湯含藥血清作用后，B16MM細胞侵襲相關基因MMP2和MMP9的mRNA表達降低，且以劑量依賴方式抑制MMP2和MMP9mRNA表達；除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 7.應用Western Blot方法檢測，加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制Bcl-2蛋白表達，增加Caspase3和Caspase9蛋白表達，除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01），加味四君子湯含藥血清作用后，B16MM細胞侵襲相關基因MMP2和MMP9的蛋白表達降低，除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 8.加味四君子湯含藥血清以劑量依賴方式抑制NF-κB(p65)蛋白表達，除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）；加味四君子湯含藥血清作用后，NF-κB (p65)活性降低，除空白對照組與血清對照比較外，各組間比較均差異有統(tǒng)計學意義（P0.01）。 結論： 1.加味四君子湯對治療肺癌有效的藥物對B16MM細胞有作用。 2.加味四君子湯含藥血清是通過下調凋亡抑制基因Bcl-2的表達，上調凋亡促進基因Caspase3和Caspase9表達來實現(xiàn)促進B16MM細胞凋亡，抑制B16MM細胞增殖。 3.加味四君子湯含藥血清是通過下調MMP2和MMP9表達來實現(xiàn)抑制B16MM細胞遷移和侵襲。 4. NF-κB(p65)是介導加味四君子湯含藥血清抑制B16惡性黑色素瘤的細胞遷移侵襲和促進凋亡的信號分子。
【關鍵詞】：加味四君子湯 惡性黑色素瘤 凋亡 侵襲 NF-κB(p65)
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2013
【分類號】：R273;R739.5
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-15
• 文獻綜述15-27
• 參考文獻23-27
• 前言27-28
• 實驗一28-41
• 1 實驗材料28-30
• 2 實驗方法30-35
• 3 統(tǒng)計分析35
• 4 結果35-41
• 實驗二41-49
• 1 實驗材料41-42
• 2 實驗方法42-44
• 3 統(tǒng)計分析44
• 4 結果44-49
• 實驗三49-53
• 1 實驗材料49-50
• 2 實驗方法50
• 3 統(tǒng)計分析50
• 4 結果50-53
• 分析討論53-67
• 結論67-68
• 參考文獻68-75
• 致謝75-76
• 個人簡歷76

【參考文獻】

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本文編號：772300