本文關(guān)鍵詞：CIRP抑制低劑量UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)細胞生長阻滯及凋亡作用的分子機制研究

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【摘要】：越來越多的證據(jù)表明紫外線(UV)造成的皮膚損傷增加了皮膚癌發(fā)生的風(fēng)險。皮膚癌包括基底細胞癌、鱗狀細胞癌以及皮膚惡性黑色素瘤,其中基底細胞癌和鱗狀細胞癌一類的非黑色素瘤皮膚癌占了皮膚癌發(fā)病的大多數(shù)。UVB過度暴露會造成細胞DNA損傷并誘導(dǎo)激活細胞內(nèi)多種信號通路,例如細胞生長抑制以及細胞凋亡。這些信號通路的激活在決定UVB照射后細胞命運的過程中扮演重要角色。但是UVB,特別是長期低劑量UVB照射誘導(dǎo)皮膚癌發(fā)生的分子機制尚在研究之中。冷誘導(dǎo)RNA結(jié)合蛋白(CIRP)在UV誘導(dǎo)倉鼠細胞DNA損傷的過程中首次被發(fā)現(xiàn)。它屬于冷休克蛋白家族(CSPs)中的一員,并能夠在響應(yīng)冷刺激過程中起RNA分子伴侶的作用。正常細胞應(yīng)激響應(yīng)時,CSPs能夠從細胞核轉(zhuǎn)移至細胞質(zhì)中,并輔助應(yīng)激狀態(tài)下細胞質(zhì)中的翻譯進程。研究報道CIRP能夠保護細胞免受TNFα和具有遺傳毒性的逆境誘導(dǎo)的細胞生長阻滯和細胞凋亡,同時還能通過p53信號通路抑制DNA損傷誘發(fā)的細胞凋亡。研究還報道CIRP與炎癥反應(yīng)以及多種腫瘤發(fā)生有密切的聯(lián)系。另外,最新的研究證明肝臟細胞中CIRP的表達水平與信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3(Stat3)的表達水平正相關(guān),而Stat3調(diào)節(jié)多種細胞信號通路,包括細胞周期、細胞凋亡以及腫瘤血管生成等。研究普遍認(rèn)為Stat3的磷酸化激活(p-Stat3)在紫外線過度暴露后皮膚癌發(fā)生過程中起十分關(guān)鍵的作用。UVB通過磷酸化Stat3蛋白705位點上的Tyr殘基來激活Stat3。研究發(fā)現(xiàn)組成型激活Stat3多與人類腫瘤以及癌細胞密切相關(guān)。但是CIRP與p-Stat3對UVB照射后的角質(zhì)細胞的調(diào)節(jié)功能還有待闡明。在本文中,我們主要研究了UVB照射處理后CIRP在調(diào)控細胞生長阻滯,細胞凋亡以及角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化中的作用,主要實驗結(jié)論如下:(1)CIRP蛋白在所有測試的黑色素瘤以及非黑色素瘤皮膚癌細胞系中都表達上調(diào);并且低劑量UVB(5 mJ/cm2)偶發(fā)或長期照射處理都能誘導(dǎo)角質(zhì)細胞上調(diào)CIRP的表達水平,而高劑量UVB(50 mJ/cm2)偶發(fā)照射處理卻降低了CIRP在細胞中的表達水平;同時我們觀察到低劑量UVB誘導(dǎo)CIRP上調(diào)的同時伴隨著其從細胞核向細胞質(zhì)中轉(zhuǎn)移。(2)UVB誘導(dǎo)的CIRP表達上調(diào)或是過表達CIRP都增強了角質(zhì)細胞對UVB誘導(dǎo)細胞生長阻滯及細胞死亡的抗性;siRNA瞬時沉默或是shRNA穩(wěn)定沉默CIRP基因都增強了角質(zhì)細胞對低劑量UVB照射處理的敏感性。(3)我們的實驗結(jié)果還證明CIRP的表達對低劑量UVB誘導(dǎo)Stat3的磷酸化激活是必須的,但是CIRP的表達變化不改變Stat3的表達總量;p-Stat3的表達與兩個已知的Stat3下游基因cyclin D1和VEGF的表達水平有關(guān)。同樣,凋亡調(diào)控因子Bag-1/S的表達也與p-Stat3的表達密切相關(guān)。(4)利用S3I-201抑制Stat3的磷酸化激活,致使p-Stat3與Bag-1/S的表達量降低,同時伴隨著UVB照射后細胞存活和增值能力的下降;穩(wěn)定過表達Bag-1/S能夠部分削弱S3I-201對低劑量UVB照射后細胞存活和增殖能力的抑制作用。(5)我們的數(shù)據(jù)還表明雖然siRNA沉默CIRP或Bag-1基因?qū)oUVB照射處理的角質(zhì)細胞中裂解PARP/PRAP的比例以及Caspase-3的激活沒有影響,但是卻能明顯增強UVB照射處理后細胞中裂解PARP/PRAP的比例以及活化的Caspase-3的表達量。此外,穩(wěn)定過表達Bag-1/S能夠完全抑制UVB誘導(dǎo)的PARP裂解以及Caspase 3的激活。根據(jù)以上結(jié)果我們提出CIRP-p(Tyr705)-Stat3信號通路,通過分別調(diào)控cyclin D1和Bag-1/S來調(diào)控UVB照射處理后細胞的增殖和存活。本實驗研究加深了我們對CIRP在低劑量UVB致癌過程中的作用的理解,研究結(jié)果證實CIRP能夠作為一個新的干預(yù)低劑量UVB誘導(dǎo)皮膚癌形成的靶點,可以為開發(fā)皮膚癌防御和治療的藥物方法提供研究基礎(chǔ),并具有臨床指導(dǎo)意義。
【關(guān)鍵詞】：CIRP Stat3 p-Stat3 Bag-1/S UVB照射 細胞存活 細胞生長
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R739.5
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-11
• 主要縮略詞11-13
• 1 緒論13-27
• 1.1 提出問題和意義14-17
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀17-24
• 1.2.1 Stat3在UVB誘導(dǎo)皮膚癌中的作用17-19
• 1.2.2 新一代原癌基因CIRP19-24
• 1.3 研究目的以及研究內(nèi)容24-27
• 1.3.1 研究目的24
• 1.3.2 主要研究內(nèi)容24-25
• 1.3.3 本研究的創(chuàng)新性25-27
• 2 CIRP在皮膚癌細胞以及UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)細胞中的表達27-47
• 2.1 前言27-28
• 2.2 實驗儀器、材料與試劑28-30
• 2.2.1 實驗儀器28
• 2.2.2 實驗材料與試劑28-30
• 2.3 實驗方法30-39
• 2.3.1 細胞復(fù)蘇、培養(yǎng)及凍存30-31
• 2.3.2 Western blot31-33
• 2.3.3 總RNA提取以及反轉(zhuǎn)錄33
• 2.3.4 重組載體構(gòu)建（pLNCX2-GFP, pLNCX2-GFP-CIRP）33-37
• 2.3.5 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染37
• 2.3.6 構(gòu)建穩(wěn)定表達GFP以及GFP-CIRP融合蛋白的HaCaT細胞株37-38
• 2.3.7 UVB照射處理38
• 2.3.8 免疫熒光染色38-39
• 2.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析39
• 2.4 實驗結(jié)果39-44
• 2.4.1 細胞培養(yǎng)39-40
• 2.4.2 CIRP在皮膚癌細胞以及低劑量UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)細胞中表達上調(diào)40
• 2.4.3 重組質(zhì)粒pLNCX2-GFP和pLNCX2-GFP-CIRP的構(gòu)建40-43
• 2.4.4 低劑量UVB照射處理后CIRP在角質(zhì)細胞中的定位43-44
• 2.5 討論44-45
• 2.6 本章小結(jié)45-47
• 3 低劑量UVB慢性暴露誘導(dǎo)角質(zhì)細胞轉(zhuǎn)化47-57
• 3.1 前言47
• 3.2 實驗儀器、材料與試劑47-49
• 3.2.1 實驗儀器47-48
• 3.2.2 實驗材料與試劑48-49
• 3.3 實驗方法49-52
• 3.3.1 UVB照射處理49-50
• 3.3.2 Western blot50-51
• 3.3.3 細胞活性檢測51
• 3.3.4 克隆生成實驗51
• 3.3.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析51-52
• 3.4 實驗結(jié)果52-54
• 3.4.1 低劑量UVB慢性暴露誘導(dǎo)HaCaT細胞轉(zhuǎn)化52-53
• 3.4.2 不同劑量UVB照射處理后HaCaT和HaCaTt細胞的生存能力53-54
• 3.5 討論54-55
• 3.6 本章小結(jié)55-57
• 4 沉默CIRP基因?qū)琴|(zhì)細胞響應(yīng)UVB照射的影響57-75
• 4.1 前言57-58
• 4.2 實驗儀器、材料與試劑58-61
• 4.2.1 實驗儀器58-59
• 4.2.2 實驗材料與試劑59-61
• 4.3 實驗方法61-65
• 4.3.1 CIRP shRNA重組載體構(gòu)建61-63
• 4.3.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染63
• 4.3.3 構(gòu)建穩(wěn)定表達scrambled-shRNA以及CIRP-shRNA63-64
• 4.3.4 UVB照射處理64
• 4.3.5 Western blot64
• 4.3.6 RNA干擾實驗64
• 4.3.7 細胞活性檢測64-65
• 4.3.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析65
• 4.4 實驗結(jié)果65-72
• 4.4.1 重組質(zhì)粒pLKO.1-scrambled-shRNA和pLKO.1-CIRP-shRNA65-66
• 4.4.2 構(gòu)建shRNA穩(wěn)定沉默CIRP基因的HaCaT細胞株66-67
• 4.4.3 shRNA穩(wěn)定沉默CIRP基因增強HaCaT細胞對UVB照射的敏感性67-69
• 4.4.4 siRNA瞬時沉默CIRP基因增強HaCaT細胞對UVB照射的敏感性69-72
• 4.5 討論72-73
• 4.6 本章小結(jié)73-75
• 5 穩(wěn)定過表達CIRP基因?qū)琴|(zhì)細胞響應(yīng)UVB照射的影響75-85
• 5.1 前言75
• 5.2 實驗儀器、材料與試劑75-78
• 5.2.1 實驗儀器75-76
• 5.2.2 實驗材料與試劑76-78
• 5.3 實驗方法78-80
• 5.3.1 CIRP過表達重組載體構(gòu)建78-79
• 5.3.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染79
• 5.3.3 構(gòu)建穩(wěn)定過表達CIRP的HaCaT細胞株79-80
• 5.3.4 UVB照射處理80
• 5.3.5 Western blot80
• 5.3.6 細胞活性檢測80
• 5.3.7 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析80
• 5.4 實驗結(jié)果80-84
• 5.4.1 重組質(zhì)粒pLenti CMV CIRP的構(gòu)建80-82
• 5.4.2 構(gòu)建CIRP穩(wěn)定過表達的HaCaT細胞株82-83
• 5.4.3 穩(wěn)定過表達CIRP基因降低HaCaT細胞對UVB照射的敏感性83-84
• 5.5 討論84
• 5.6 本章小結(jié)84-85
• 6 CIRP-p-Stat3調(diào)控低劑量UVB誘導(dǎo)的Bag-1/S表達變化85-99
• 6.1 前言85
• 6.2 實驗儀器、材料與試劑85-88
• 6.2.1 實驗儀器85-86
• 6.2.2 實驗材料與試劑86-88
• 6.3 實驗方法88-91
• 6.3.1 Bag-1/S過表達重組載體構(gòu)建88-90
• 6.3.2 質(zhì)粒瞬時轉(zhuǎn)染90
• 6.3.3 構(gòu)建穩(wěn)定過表達Bag-1/S的HaCaT細胞株90
• 6.3.4 藥物S3I-201處理以及藥物低劑量UVB聯(lián)合處理HaCaT細胞90
• 6.3.5 UVB照射處理90
• 6.3.6 S3I-201的細胞毒性檢測90-91
• 6.3.7 Western blot91
• 6.3.8 細胞活性檢測91
• 6.3.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析91
• 6.4 實驗結(jié)果91-97
• 6.4.1 低劑量UVB誘導(dǎo)Bag-1/S表達上調(diào)需要激活Stat391-92
• 6.4.2 構(gòu)建Bag-1/S穩(wěn)定過表達的HaCaT細胞株92-94
• 6.4.3 CIRP-Stat3-Bag-1/S信號調(diào)控UVB照射后HaCaT細胞的存活和增殖94-97
• 6.5 討論97-98
• 6.6 本章小結(jié)98-99
• 7 CIRP以及Bag-1/S調(diào)控UVB誘導(dǎo)的角質(zhì)細胞凋亡99-107
• 7.1 前言99
• 7.2 實驗儀器、材料與試劑99-101
• 7.2.1 實驗儀器99-100
• 7.2.2 實驗材料與試劑100-101
• 7.3 實驗方法101-102
• 7.3.1 RNA干擾實驗101-102
• 7.3.2 UVB照射處理102
• 7.3.3 Western blot102
• 7.4 實驗結(jié)果102-104
• 7.4.1 CIRP和Bag-1/S調(diào)控UVB誘導(dǎo)的細胞凋亡102-103
• 7.4.2 Bag-1/S過表達抑制UVB誘導(dǎo)的細胞凋亡103-104
• 7.5 討論104-105
• 7.6 本章小結(jié)105-107
• 8 結(jié)論與展望107-111
• 8.1 主要結(jié)論107-109
• 8.2 工作展望109-111
• 致謝111-113
• 參考文獻113-131
• 附錄 作者在攻讀博士學(xué)位期間發(fā)表論文及專利情況131

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本文編號：751553