本文關(guān)鍵詞：XPA在黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥中的作用及機(jī)制研究

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【摘要】：背景:黑素瘤是起源于表皮黑素細(xì)胞的惡性腫瘤,其致死率高、治療困難。除了早期切除外,目前針對(duì)中晚期黑素瘤尚無(wú)有效的治療方法。作為經(jīng)典的化療藥物,順鉑與其他化療藥物或免疫、靶向藥物聯(lián)合可增加臨床治療的有效率,特別是對(duì)一線治療后無(wú)效、進(jìn)展以及復(fù)發(fā)的患者,順鉑治療仍具有重要作用。然而腫瘤細(xì)胞化療耐藥的發(fā)生極大的限制了順鉑等鉑類藥物的臨床應(yīng)用,因此深入探討黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制對(duì)黑素瘤患者,特別是中晚期患者的治療尤為重要。順鉑可與DNA形成鏈內(nèi)及鏈間加合物抑制細(xì)胞復(fù)制及轉(zhuǎn)錄,并最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。核苷酸切除修復(fù)(nucleotide excision repair,NER)可修復(fù)受損DNA,抑制凋亡發(fā)生,是腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥的主要原因。作為NER中的關(guān)鍵分子,著色性干皮病A組(Xeroderma pigmentosum group A,XPA)蛋白具有識(shí)別損傷、穩(wěn)定修復(fù)結(jié)構(gòu)及招募下游修復(fù)蛋白的多種作用。既往在鼻咽癌、肺腺癌、前列腺癌等癌癥的研究中發(fā)現(xiàn),XPA高表達(dá)是腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥的重要原因。然而XPA是否參與黑素瘤順鉑耐藥,目前尚未闡明。自噬是細(xì)胞內(nèi)重要的生理過(guò)程,其通過(guò)降解并再利用細(xì)胞內(nèi)變性、受損及失去功能的細(xì)胞器及蛋白等成分維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)態(tài)并為細(xì)胞提供必要的營(yíng)養(yǎng)成分。大量研究表明化療藥物作用于腫瘤細(xì)胞后,細(xì)胞內(nèi)自噬水平增加并可導(dǎo)致耐藥發(fā)生。然而腫瘤細(xì)胞內(nèi)調(diào)控自噬應(yīng)對(duì)化療打擊的機(jī)制目前尚未完全闡明。研究表明,針對(duì)DNA損傷的修復(fù)過(guò)程常會(huì)消耗大量能量,而自噬恰恰具有能量供給功能,提示損傷修復(fù)可能是化療藥物治療后自噬激活的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。此外,已有研究證實(shí)化療藥物作用后,一些dna修復(fù)分子可直接參與激活細(xì)胞內(nèi)自噬水平。最新的一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn),xpa缺陷細(xì)胞內(nèi)存在線粒體自噬障礙,提示xpa可能參與細(xì)胞內(nèi)自噬的調(diào)控�；谝陨涎芯堪l(fā)現(xiàn),我們提出以下科學(xué)假說(shuō):順鉑作用于黑素瘤細(xì)胞后,ner通路活化促進(jìn)dna損傷修復(fù)并介導(dǎo)自噬激活,造成腫瘤細(xì)胞順鉑耐藥。xpa作為ner修復(fù)中的重要分子,可能在該過(guò)程中發(fā)揮關(guān)鍵的調(diào)控作用。目的:1.分析并驗(yàn)證xpa表達(dá)水平與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)性;2.闡明xpa參與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的分子機(jī)制。方法:1.利用qrt-pcr技術(shù)對(duì)黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞xpamrna水平進(jìn)行檢測(cè);同時(shí),利用細(xì)胞增殖與毒性檢測(cè)試劑盒(cellcountingkit-8assay,cck8)對(duì)順鉑處理后黑素細(xì)胞及黑素瘤細(xì)胞活性進(jìn)行檢測(cè)并對(duì)順鉑ic50值進(jìn)行計(jì)算;明確二者的相關(guān)性;2.干涉xpa表達(dá),利用cck8檢測(cè)xpa干涉對(duì)黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的影響;利用westernblot、流式技術(shù)檢測(cè)xpa干涉對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的影響;3.分別利用westernblot、電鏡、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)順鉑處理對(duì)黑素瘤細(xì)胞自噬水平的影響;4.干涉xpa表達(dá),利用westernblot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)xpa干涉對(duì)順鉑誘導(dǎo)自噬的影響;5.干涉xpa表達(dá),利用westernblot技術(shù)檢測(cè)xpa干涉對(duì)parp1活化的影響;6.干涉parp1表達(dá)或應(yīng)用parp1抑制劑,利用westernblot、免疫熒光技術(shù)檢測(cè)parp1干涉及活性抑制對(duì)順鉑誘導(dǎo)自噬的影響;7.干涉parp1表達(dá),利用westernblot技術(shù)檢測(cè)parp1干涉對(duì)mtor活化、hmgb1出核及表達(dá)的影響;8.干涉atg12或parp1表達(dá),利用克隆形成技術(shù)檢測(cè)atg12或parp1干涉對(duì)順鉑誘導(dǎo)細(xì)胞毒性的影響;結(jié)果:1.與黑素細(xì)胞系相比,不同黑素瘤細(xì)胞系中XPA表達(dá)水平均升高且與順鉑耐藥水平呈正相關(guān);選取XPA高表達(dá)且耐藥性高的Hs294T、A2058兩株細(xì)胞系為研究對(duì)象進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn);2.CCK8結(jié)果顯示:干涉XPA表達(dá)可增加黑素瘤細(xì)胞順鉑敏感性;3.Western blot及流式結(jié)果顯示:干涉XPA表達(dá)可增加順鉑誘導(dǎo)的Caspase3活化及細(xì)胞凋亡的發(fā)生;4.Western blot、電鏡、免疫熒光結(jié)果顯示:順鉑處理后黑素瘤細(xì)胞內(nèi)自噬水平增加;5.Western blot及免疫熒光結(jié)果顯示:干涉XPA表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬水平增加;5.Western blot結(jié)果顯示:干涉XPA表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的PARP1活化;6.Western blot、免疫熒光結(jié)果顯示:干涉PARP1表達(dá)或抑制PARP1活性可抑制順鉑誘導(dǎo)的自噬水平增加;7.Western blot結(jié)果顯示:干涉PARP1表達(dá)可抑制順鉑誘導(dǎo)的HMGB1表達(dá)增加及出核;8.克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:干涉ATG12或PARP1表達(dá)可增加黑素細(xì)胞順鉑敏感性,且干涉PARP1的治療效果優(yōu)于干涉ATG12。結(jié)論:通過(guò)本課題的研究,我們首次發(fā)現(xiàn)黑素瘤細(xì)胞中順鉑處理后XPA可通過(guò)活化PARP1促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)自噬水平升高。這一機(jī)制與XPA介導(dǎo)的NER修復(fù)共同促進(jìn)黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的發(fā)生。我們的發(fā)現(xiàn)加深了對(duì)黑素瘤順鉑耐藥機(jī)制的認(rèn)識(shí),也為黑素瘤化療聯(lián)合治療提供了新的靶點(diǎn)。
【關(guān)鍵詞】：黑素瘤 順鉑 XPA 自噬 PARP1
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R739.5
【目錄】：

• 縮略語(yǔ)表5-8
• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-29
• 1. 黑素瘤及順鉑治療17-18
• 1.1 順鉑的藥理作用機(jī)制17
• 1.2 順鉑在黑素瘤中的治療現(xiàn)狀17-18
• 2. 細(xì)胞對(duì)順鉑耐藥的機(jī)制18-20
• 2.1 DNA損傷修復(fù)18-19
• 2.2 藥物運(yùn)輸19
• 2.3 凋亡抵抗19
• 2.4 細(xì)胞自噬19-20
• 3. XPA20-24
• 3.1 XPA的結(jié)構(gòu)20-21
• 3.2 XPA的轉(zhuǎn)錄后修飾21-22
• 3.3 XPA的生理功能22-24
• 4. PARP124-29
• 4.1 PARP1的結(jié)構(gòu)與酶活性24
• 4.2 PARP1的生理功能24-29
• 1 材料29-41
• 1.1 主要儀器設(shè)備29-30
• 1.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑30-33
• 1.3 其它材料33-35
• 1.4 實(shí)驗(yàn)溶液配方35-41
• 2 方法41-57
• 2.1 XPA與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)性分析及驗(yàn)證41-52
• 2.2 XPA參與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制研究52-57
• 3 結(jié)果57-76
• 3.1 XPA與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的相關(guān)性分析及驗(yàn)證57-63
• 3.2 XPA參與黑素瘤細(xì)胞順鉑耐藥的機(jī)制研究63-76
• 4 討論76-83
• 小結(jié)83-84
• 參考文獻(xiàn)84-94
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷和研究成果94-96
• 致謝96

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本文編號(hào)：743252