本文關(guān)鍵詞：miR-203與SOCS3的相互作用及其在HaCaT細胞中的機制研究

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【摘要】：[研究目的] microRNAs (miRNAs)是一種類似于siRNA的,長約19～25個核苷酸的小分子非編碼RNA,廣泛存在于動植物和哺乳動物體內(nèi),它能與靶分子3'端非編碼區(qū)域(3'-untranslated region,3'UTR)特異性結(jié)合,能抑制轉(zhuǎn)錄后翻譯或蛋白降解,從而參與細胞增殖、凋亡、分化、代謝、發(fā)育、腫瘤轉(zhuǎn)移等多種生物學(xué)過程。估計有1048種miRNAs參與了人類基因的調(diào)控。因此,對于microRNAs的作用,尤其是其靶基因的鑒定和研究,是目前研究的主要熱點之一。 MiR-203是一個皮膚特異性表達的miRNA,并在銀屑病的表皮中表達增加,與此同時,SOCS3(STAT-Induced STAT Inhibitor3)的表達下降。在腫瘤中的大量研究顯示：1miR-203具有抑制細胞增殖的作用,并能與特異性的靶分子結(jié)合從而在疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用。 鑒于以上研究背景,在本研究中我們主要探討miR-203與SOCS3之間的關(guān)系,以及在人類永生化細胞株(HaCaT)細胞中作用機制。 [研究方法和結(jié)果] 1.基于生物信息學(xué)在線軟件預(yù)測及數(shù)據(jù)庫比對的方法,發(fā)現(xiàn)SOCS3基因3'UTR區(qū)位于miR-203結(jié)合的“種子”序列上,預(yù)測兩者可能存在相互結(jié)合從而改變基因表達水平。 2.通過熒光素報告基因分析方法,觀察miR-203與SOCS3的結(jié)合情況,在外源給予'mimic miRNA-203'序列和包含SOCS3基因3'UTR區(qū)的熒光素酶報告基因載體共同轉(zhuǎn)染HEK293T細胞的實驗中,發(fā)現(xiàn)熒光素酶報告基因的活性下降。 3.采用western blot的方法進一步驗證了miR-203對SOCS3表達的影響,采用miR-203的模擬劑瞬時轉(zhuǎn)染HEK293T細胞后,SOCS3的蛋白水平顯著降低。 4.采用western blot的方法觀察miR-203的模擬劑對STAT3(Signal Transducers and Activators of Transcription, are transcription factors3)信號通路的影響。 5.采用流式細胞儀的方法。我們發(fā)現(xiàn)miRNA-203模擬劑能增加在S期的細胞數(shù)量。 6.為進一步了解miRNA-203在銀屑病治療中的作用。阿維A誘導(dǎo)的HaCaT細胞外源性給予miR-203的抑制劑,采用流式細胞儀觀察其細胞周期。我們發(fā)現(xiàn)阿維A能增加S期細胞數(shù)量,減慢細胞增殖,但這種效應(yīng)被1miR-203的抑制劑所逆轉(zhuǎn)。 [結(jié)論] 1.SOCS3基因是miR-203的一個潛在靶基因； 2. miR-203負向調(diào)控SOCS3,并活化STAT3信號通路； 3.阿維A能影響HaCaT細胞的細胞周期,這種作用能被miR-203的抑制劑所逆轉(zhuǎn)；
【關(guān)鍵詞】：miR-203 阿維A SOCS3 STAT3
【學(xué)位授予單位】：中南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2013
【分類號】：R758.63
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-11
• 前言11-13
• 第一章 miR-203靶基因研究13-26
• 1 材料與方法13-14
• 1.1 主要試劑和儀器13-14
• 2 實驗方法14-19
• 2.1 生物信息學(xué)方法預(yù)測14
• 2.2 構(gòu)建報告基因質(zhì)粒14-16
• 2.3 報告基因質(zhì)粒的連接16-17
• 2.4 報告基因質(zhì)粒的鑒定17
• 2.5 細胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染17-18
• 2.6 熒光素酶報告基因活性檢測18-19
• 3 統(tǒng)計學(xué)分析19
• 4 結(jié)果19-24
• 4.1 miR-203潛在靶基因預(yù)測結(jié)果19-20
• 4.2 報告基因質(zhì)粒的構(gòu)建和鑒定20-23
• 4.3 SOCS3是miR-203的直接的靶基因23-24
• 5 討論24-26
• 第二章 miR-203負向調(diào)控SOCS3,并活化STAT3信號通路26-46
• 1 材料與方法26-27
• 1.1 主要試劑和儀器26-27
• 2 實驗方法27-39
• 2.1 設(shè)計并合成SOCS3和內(nèi)參照β-actin的引物27
• 2.2 HEK293T細胞中總RNA抽提27-28
• 2.3 逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)28
• 2.4 real-time PCR反應(yīng)28-29
• 2.5 Western Blotting法檢測SOCS3,STAT3和p-STAT3蛋白的表達水平29-35
• 2.6 人胚腎細胞(HEK293T細胞)中miR-203的表達35-38
• 2.7 細胞培養(yǎng)實驗分組38-39
• 3 統(tǒng)計學(xué)分析39-40
• 4 實驗結(jié)果40-42
• 4.1 miR-203降低SOCS3的表達40-41
• 4.2 miR-203模擬劑對STAT3信號通路的影響41
• 4.3 miR-203模擬劑能抑制HaCaT細胞增殖41-42
• 4.4 miR203抑制劑能逆轉(zhuǎn)阿維A對HaCaT細胞的抗增殖作用42
• 5 討論42-45
• 6 結(jié)論45-46
• 參考文獻46-50
• 綜述50-81
• 參考文獻69-81
• 攻讀學(xué)位期間主要的研究成果81-82
• 致謝82

【共引文獻】

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本文編號：722552