本文關(guān)鍵詞：梅毒螺旋體鞭毛蛋白免疫活性分析及其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的分子機(jī)制

  更多相關(guān)文章： 梅毒螺旋體 鞭毛蛋白 血清學(xué)診斷 基質(zhì)金屬蛋白酶 角質(zhì)形成細(xì)胞

【摘要】：背景與目的:梅毒是由梅毒螺旋體(Treponema pallidum,Tp)引起的嚴(yán)重危害人類健康的性傳播疾病,其傳播途徑與艾滋病相同,且可明顯增加感染和傳播艾滋病的危險(xiǎn)性。近年來梅毒發(fā)病率躍居我國各類性傳播疾病之首,快速準(zhǔn)確的診斷對于預(yù)防和控制梅毒具有重要意義。迄今為止,Tp的致病機(jī)制和致病物質(zhì)仍不清楚,細(xì)菌鞭毛蛋白作為一種經(jīng)典病原相關(guān)分子模式,在促進(jìn)病原體侵襲和誘導(dǎo)宿主炎癥反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。角質(zhì)形成細(xì)胞是皮膚屏障中重要的免疫前哨細(xì)胞,參與皮膚免疫炎癥反應(yīng)。因此,我們推測:Tp鞭毛蛋白可能通過誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶,進(jìn)而降解細(xì)胞外基質(zhì),引起皮膚免疫炎癥反應(yīng)并促進(jìn)Tp侵襲。本研究旨在通過原核表達(dá)重組Tp鞭毛蛋白,分析其免疫原性和免疫反應(yīng)性,評價(jià)其是否具有候選抗原的價(jià)值。同時(shí),以人皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞為靶細(xì)胞,明確Tp鞭毛蛋白能否通過TLR5激活角質(zhì)形成細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶,闡明Tp鞭毛蛋白誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞基質(zhì)金屬蛋白酶的相關(guān)信號通路。本研究將為闡明Tp分子致病機(jī)制提供新思路和依據(jù),對梅毒防控具有重要現(xiàn)實(shí)意義。方法:1.以Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株基因組DNA為模板,PCR擴(kuò)增Tp鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3全基因片段;構(gòu)建p ET28a-Fla B1(Fla B2、Fla B3)原核表達(dá)載體;酶切、測序鑒定后,轉(zhuǎn)化至表達(dá)宿主菌E.coli BL21(DE3)中。2.IPTG誘導(dǎo)重組鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3表達(dá),Western Blot對表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行分析和鑒定;用Ni2+-NTA親和層析柱純化重組蛋白,BCA法測定蛋白濃度。3.以Tp Nichols株,Chicago株和Tp臨床分離株(nhgz01和nhgz02)建立梅毒感染動(dòng)物模型,收集感染兔血清,Western Blot檢測重組鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3與感染兔血清和梅毒患者血清的免疫反應(yīng)性。4.重組鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3免疫新西蘭兔,收集免疫血清,Western Blot和ELISA法檢測重組蛋白的免疫原性和免疫反應(yīng)性。5.建立重組鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3 ELISA方法,檢測各期梅毒患者血清、交叉血清及陰性血清中特異性Ig G和Ig M,初步評價(jià)重組蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3在梅毒血清學(xué)診斷中的應(yīng)用價(jià)值。6.培養(yǎng)人永生化的角質(zhì)形成細(xì)胞(Ha Ca T),以10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3分別刺激Ha Ca T細(xì)胞48h后,蛋白芯片檢測基質(zhì)金屬蛋白酶的表達(dá)變化。7.以不同濃度0.1、1、10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3分別刺激Ha Ca T細(xì)胞24h后,RT-PCR檢測MMP-9、MMP-13的m RNA表達(dá)水平,明膠酶譜實(shí)驗(yàn)和Western Blot檢測MMP-9的活性和表達(dá)水平,ELISA法檢測MMP-13的表達(dá)水平。8.Ha Ca T細(xì)胞轉(zhuǎn)染2μg TLR5、TLR2、TLR4、My D88特異性干擾質(zhì)粒和對照質(zhì)粒后培養(yǎng)24h,隨后用10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激培養(yǎng)48h,Western Blot和ELISA分別檢測MMP-9、MMP-13的表達(dá)變化。9.分別用終濃度為10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞15min、30min、60min、120min后,Western Blot檢測ERK、JNK、p38磷酸化水平。10.分別用終濃度為10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞15min、30min、60min、120min后,Western Blot檢測細(xì)胞中總IκBα的降解水平,磷酸化IκBα的表達(dá)水平。用10μg/m L的Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞2h后,免疫熒光檢測NF-κB p65亞基核轉(zhuǎn)位情況。11.采用特異性抑制劑ERK(10μM PD98059)、JNK(20μM SP600125)、p38MAPK(10μM SB203580)、NF-κB(10μM BAY117082)預(yù)處理Ha Ca T細(xì)胞后,用終濃度為10μg/m L Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞48h,Western Blot和ELISA分別檢測MMP-9、MMP-13的表達(dá)變化。結(jié)果:1.PCR擴(kuò)增獲得與目的片段大小相符的基因片段:Fla B1(861bp)、Fla B2(861bp)、Fla B3(858bp),重組質(zhì)粒經(jīng)測序鑒定與目的基因一致。2.IPTG誘導(dǎo)表達(dá)出相對分子量約為36 k Da(Fla B1),35 k Da(Fla B2),34 k Da(Fla B3)的目的蛋白,經(jīng)Ni2+-NTA純化后BCA測定濃度約為2mg/m L。3.在新西蘭兔感染Tp Nichols標(biāo)準(zhǔn)株,Chicago株及Tp臨床分離株(nhgz-01和nhgz-02)后獲取的梅毒感染兔血清,以及梅毒患者血清中均檢測到Fla B1、Fla B2和Fla B3特異性抗體的表達(dá)。4.Tp鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3在初次免疫后7天,抗血清中即可檢測出鞭毛蛋白的相應(yīng)Ig G抗體,三次免疫后獲取的免疫血清效價(jià)達(dá)到1:51200。5.各蛋白Ig G ELISA總的敏感性分別為:Fla B1(95.4%)、Fla B2(92.6%)和Fla B3(95.1%),在Ig M ELISA中,重組蛋白對一期梅毒和先天梅毒表現(xiàn)了較好的敏感性,其敏感性分別為:Fla B1(76.8%,83.1%)、Fla B2(72.0%,87.7%)和Fla B3(74.4%,89.2%);Ig G ELISA總的特異性分別為:Fla B1(98.9%)、Fla B2(95.8%)和Fla B3(95.8%),在Ig M ELISA中,其特異性分別為:Fla B1(96.8%)、Fla B2(97.9%)和Fla B3(95.8%)。6.鞭毛蛋白誘導(dǎo)Ha Ca T表達(dá)多種MMPs和TIMP,其中MMP-13,TIMP-1,TIMP-2在三組中表達(dá)量均明顯升高;僅Fla B1可誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)量顯著升高。7.Fla B1誘導(dǎo)MMP-9 m RNA和蛋白表達(dá)呈濃度依賴性,10μg/m L Fla B1可誘導(dǎo)MMP-9 m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。MMP-13 m RNA和蛋白表達(dá)水平也呈濃度依賴性,當(dāng)?shù)鞍诐舛冗_(dá)到10μg/m L時(shí),可引起MMP-13 m RNA和蛋白表達(dá)水平顯著升高。8.Ha Ca T細(xì)胞轉(zhuǎn)染TLR5和My D88干擾質(zhì)粒后可顯著抑制MMP-9、MMP-13的表達(dá),而轉(zhuǎn)染TLR2和TLR4干擾質(zhì)粒后,MMP-9、MMP-13的表達(dá)量無明顯改變。9.Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞后可誘導(dǎo)ERK、JNK、p38發(fā)生不同程度磷酸化且呈一定的時(shí)間依賴性。10.Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞后,IκBα發(fā)生不同程度的降解和磷酸化且呈一定的時(shí)間依賴性。Fla B1、Fla B2、Fla B3刺激Ha Ca T細(xì)胞2h后,NF-κB p65亞基發(fā)生了不同程度的核轉(zhuǎn)位。11.Ha Ca T細(xì)胞采用特異性抑制劑處理后,Fla B1誘導(dǎo)MMP-9的表達(dá)量被顯著抑制,但是p38特異性抑制劑SB203580處理細(xì)胞后,MMP-13的表達(dá)水平與對照組比較,無顯著性差異。結(jié)論:1.梅毒螺旋體鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3具有較強(qiáng)免疫活性,能夠誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性免疫應(yīng)答,可做為梅毒血清診斷候選抗原。2.梅毒螺旋體鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3經(jīng)TLR5/My D88依賴途徑激活Ha Ca T細(xì)胞表達(dá)MMP-9和MMP-13。3.MAPK和NF-κB信號通路參與調(diào)控梅毒螺旋體鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2和Fla B3誘導(dǎo)Ha Ca T細(xì)胞表達(dá)MMP-9和MMP-13。
【關(guān)鍵詞】：梅毒螺旋體 鞭毛蛋白 血清學(xué)診斷 基質(zhì)金屬蛋白酶 角質(zhì)形成細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：南華大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R759.1
【目錄】：

• 摘要4-9
• Abstract9-15
• 中英文縮略詞15-19
• 前言19-23
• 第一章 梅毒螺旋體鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3的克隆、表達(dá)與純化23-49
• 1 材料25-28
• 2 方法28-40
• 3 結(jié)果40-48
• 4 討論48
• 5 小結(jié)48-49
• 第二章 梅毒螺旋體鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3免疫活性分析49-71
• 1 材料51-53
• 2 方法53-57
• 3 結(jié)果57-67
• 4 討論67-70
• 5 小結(jié)70-71
• 第三章 梅毒螺旋體鞭毛蛋白Fla B1、Fla B2、Fla B3誘導(dǎo)Ha Ca T細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的分子機(jī)制71-121
• 1 材料73-76
• 2 方法76-87
• 3 結(jié)果87-116
• 4 討論116-120
• 5 小結(jié)120-121
• 結(jié)論121-123
• 參考文獻(xiàn)123-133
• 文獻(xiàn)綜述133-151
• 參考文獻(xiàn)143-151
• 附錄151-159
• 攻讀學(xué)位期間的科研成果159-161
• 本研究受以下基金資助161-163
• 致謝163

【相似文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 馬強(qiáng);耿焱;黃茂梁;吳英松;李明;;梅毒螺旋體0751基因的克隆、表達(dá)及鑒定[J];熱帶醫(yī)學(xué)雜志;2011年06期

2 楊秋;揭開梅毒螺旋體的基因真相[J];國外科技動(dòng)態(tài);1999年05期

3 強(qiáng)軍,張會孝,張經(jīng)華;對一例涉外梅毒螺旋體感染者的處理[J];口岸衛(wèi)生控制;2000年02期

4 黃建香 ,余崇鎬 ,林偉珍;梅毒螺旋體的檢測結(jié)果分析[J];現(xiàn)代醫(yī)藥衛(wèi)生;2002年11期

5 周毅;老年梅毒螺旋體感染51例調(diào)查與分析[J];中國現(xiàn)代醫(yī)藥雜志;2004年05期

6 劉鵬,馮國基;梅毒螺旋體的檢測技術(shù)與應(yīng)用現(xiàn)狀[J];實(shí)用醫(yī)藥雜志;2005年10期

7 王華;雷麗明;李代渝;;梅毒螺旋體血清學(xué)檢測方法及應(yīng)用[J];實(shí)用診斷與治療雜志;2006年09期

8 孔秋虹;;不同檢測方法對梅毒螺旋體感染的評價(jià)[J];現(xiàn)代中西醫(yī)結(jié)合雜志;2008年07期

9 凌聰;;三種梅毒螺旋體檢測方法的臨床評價(jià)[J];河北醫(yī)學(xué);2008年03期

10 韓潔;張海萍;朱威;連石;;梅毒螺旋體相關(guān)膜蛋白的研究進(jìn)展[J];中華臨床醫(yī)師雜志(電子版);2010年10期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前9條

1 張俊艷;劉全忠;;梅毒螺旋體的檢測方法及應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第十五次全國皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文集[C];2009年

2 李秀玉;王培昌;楊瓏;李文軍;;梅毒螺旋體檢測方法及應(yīng)用[A];中華醫(yī)學(xué)會第九次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中國醫(yī)院協(xié)會臨床檢驗(yàn)管理專業(yè)委員會第六屆全國臨床檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室管理學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2011年

3 許友強(qiáng);李慧源;;梅毒螺旋體特異性IgG抗體親和力的測定及其臨床意義的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

4 莊亦暉;陳瑜;蔣燕群;;Determine Syphilis TP方法在梅毒螺旋體血清學(xué)診斷中的臨床評價(jià)[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

5 唐書謙;葉慶佾;;剛果紅染色法檢查梅毒螺旋體[A];2003中國中西醫(yī)結(jié)合皮膚性病學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2003年

6 王林娜;鄭和義;;梅毒螺旋體基因檢測以及治療前后螺旋體DNA載量變化的研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第14次全國皮膚性病學(xué)術(shù)年會論文匯編[C];2008年

7 劉雙全;趙飛駿;張秋桂;吳移謀;;梅毒螺旋體Tp0751黏附蛋白的表達(dá)、純化及免疫活性研究[A];中華醫(yī)學(xué)會第八次全國檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)學(xué)術(shù)會議暨中華醫(yī)學(xué)會檢驗(yàn)分會成立30周年慶典大會資料匯編[C];2009年

8 梁平;湯伍輝;邵群;李慧英;李彬;魏建萍;;梅毒螺旋體IgM蛋白印跡試驗(yàn)診斷先天性梅毒評價(jià)[A];江西省第五次中西醫(yī)結(jié)合皮膚科學(xué)術(shù)交流會論文集[C];2006年

9 莫穎;林晶;陳萬;梁云燕;劉曉芳;關(guān)善斌;梁綱;莫書榮;;吸毒者與HCV、HIV及梅毒螺旋體感染的相關(guān)研究[A];中南地區(qū)第六屆生理學(xué)學(xué)術(shù)會議論文摘要匯編[C];2004年

中國重要報(bào)紙全文數(shù)據(jù)庫 前4條

1 江西醫(yī)學(xué)院二附院 主任醫(yī)師 俞景明;梅毒螺旋體：我的自白[N];家庭醫(yī)生報(bào);2004年

2 湖南省性病控制中心 丁勝非;怎樣看梅毒化驗(yàn)單[N];大眾衛(wèi)生報(bào);2000年

3 本報(bào)記者 李振輝 通訊員 劉東紅;哪些性病癥狀 會表現(xiàn)在眼部[N];廣東科技報(bào);2008年

4 由它;眼睛也會被性病毒傷害[N];保健時(shí)報(bào);2005年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前5條

1 田洪青;山東地區(qū)梅毒螺旋體基因分型研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2014年

2 蔣傳好;梅毒螺旋體鞭毛蛋白免疫活性分析及其誘導(dǎo)HaCaT細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)金屬蛋白酶的分子機(jī)制[D];南華大學(xué);2016年

3 張良芬;編碼梅毒螺旋體47-、17-和15kD脂蛋白的基因克隆、表達(dá)及表達(dá)產(chǎn)物反應(yīng)原性的初步鑒定[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學(xué);2001年

4 戴婷;上海地區(qū)梅毒患者梅毒螺旋體基因分型及與神經(jīng)梅毒相關(guān)性的初步研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

5 龍福泉;梅毒螺旋體膜蛋白的表達(dá)、純化及其免疫活性的研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院;2012年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 薛愛鳳;萊城區(qū)育齡婦女孕前五種病原體感染狀況及相關(guān)因素分析[D];泰山醫(yī)學(xué)院;2014年

2 史金龍;新疆梅毒螺旋體大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因突變位點(diǎn)23SrRNA2058G檢測[D];新疆醫(yī)科大學(xué);2016年

3 陳潔;梅毒螺旋體的免疫組化法檢測意義[D];浙江大學(xué);2012年

4 李珍;梅毒螺旋體大環(huán)內(nèi)酯類抗生素耐藥基因突變位點(diǎn)檢測[D];濟(jì)南大學(xué);2014年

5 肖潔;梅毒螺旋體特異診斷抗原的篩選、制備及臨床應(yīng)用初探[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2007年

6 牛淑會;梅毒螺旋體候選診斷抗原的表達(dá)及臨床初步應(yīng)用[D];南華大學(xué);2012年

7 甘霖;梅毒螺旋體膜蛋白Tp92致炎作用機(jī)制的初步研究[D];南華大學(xué);2015年

8 湯鎮(zhèn);重慶地區(qū)梅毒螺旋體基因分型及其臨床相關(guān)性研究[D];重慶醫(yī)科大學(xué);2015年

9 劉小軍;梅毒螺旋體Tp0463蛋白的表達(dá)及其在臨床血清學(xué)診斷中應(yīng)用的初步評價(jià)[D];南華大學(xué);2011年

10 朱洪;梅毒螺旋體粘附素Tp0751重組菌影制備與免疫活性的初步研究[D];南華大學(xué);2015年

，

本文編號：720633